Desarrollo de ingredientes funcionales con nuevos péptidos antihipertensivos a partir de proteínas lácteas: Evaluación de la estabilidad y biodisponibilidad

Abstract

En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el desarrollo y la producción de un ingrediente funcional con actividad antihipertensiva procedente de proteínas lácteas mediante hidrólisis enzimática. Esta tesis se ha estructurado en seis partes: En el primer apartado se han identificado nuevos péptidos antihipertensivos a partir de caseína isoeléctrica hidrolizada con pepsina. El hidrolizado más activo se fraccionó mediante ultrafiltración y RP-HPLC a escala semipreparativa. Se secuenciaron 44 péptidos en las fracciones más activas mediante RP-HPLC-MS/MS. De entre los péptidos identificados, los péptidos RYLGY, αs1-caseína f(90-94), AYFYPEL, αs1-caseína f(143-149), e YQKFPQY, αs2-caseína f(89-95), ejercieron una potente actividad inhibidora de la ECA y antioxidante in vitro. Además, exhibieron propiedades antihipertensivas en ratas espontáneamente hipertensas (SHR). En un segundo apartado, se ha desarrollado y validado un método cuantitativo mediante RP-HPLC-MS para la determinación simultánea de los péptidos RYLGY y AYFYPEL en hidrolizados de proteínas lácteas y en leches fermentadas. Asimismo, para la obtención de los péptidos de interés, se optimizó el proceso de hidrólisis en el laboratorio y se evaluaron las principales variables de hidrólisis, concretamente, el sustrato, la relación de enzima/sustrato, la temperatura y el tiempo de hidrólisis. Se comprobó que las variables afectaban de distinta manera a la formación de los péptidos RYLGY y AYFYPEL. Además, se obtuvo el mayor contenido total de ambos péptidos a partir de la hidrólisis de leche en polvo con pepsina mediante el empleo de la mayor relación de enzima/sustrato y tiempos de hidrólisis comprendidos entre 8 y 10 horas. Posteriormente, se monitorizó la producción de los péptidos activos en hidrolizados de leche en polvo preparados a escala piloto.

En el tercer apartado se desarrolló a escala industrial un ingrediente funcional antihipertensivo a partir de caseína comercial hidrolizada con pepsina y con los péptidos RYLGY y AYFYPEL. Previamente, para obtener el máximo contenido de los péptidos de interés, se optimizó el proceso de hidrólisis en el laboratorio empleando condiciones compatibles con la alimentación. Para ello, se empleó pepsina de grado alimentario y se evaluó el efecto de la relación de enzima/sustrato y del tiempo de hidrólisis. Se seleccionaron las condiciones óptimas para llevar a cabo el escalado industrial del proceso de hidrólisis y se evaluó el efecto del secado mediante liofilización y atomización sobre la bioactividad del hidrolizado y los péptidos activos. Posteriormente, se evaluó el enriquecimiento en los péptidos de interés mediante ultrafiltración y la mejora del sabor del hidrolizado mediante encapsulación y con la incorporación de un aditivo. Además, se caracterizaron los ingredientes obtenidos. Se comprobó que la actividad inhibidora de la ECA y las propiedades antihipertensivas de los diferentes ingredientes se mantenían durante el proceso de secado. Además, los péptidos RYLGY y AYFYPEL fueron estables. El análisis sensorial indicó que la incorporación de un aditivo durante el proceso de hidrólisis reducía el amargor del hidrolizado y, por tanto, mejoraba su sabor. En el cuarto apartado se evaluó la viabilidad de la incorporación del ingrediente funcional desarrollado en leches fermentadas. Se estudió la incorporación del ingrediente a distintas escalas, escala de laboratorio, piloto e industrial, y el momento de la incorporación del ingrediente a la leche fermentada Además, se evaluó el efecto de la homogenización y pasteurización sobre los péptidos RYLGY y AYFYPEL y la estabilidad de los mismos durante la vida útil de las leches fermentadas en refrigeración. En este estudio se pudieron establecer las mejores condiciones para la incorporación del ingrediente y se demostró la estabilidad de los péptidos durante el procesado y durante la vida útil de las leches fermentadas a 4ºC.

En el quinto apartado, se han realizado estudios de biodisponibilidad de los péptidos RYLGY y AYFYPEL. Los péptidos se sometieron a un proceso que simulaba la digestión gastrointestinal fisiológica y se secuenciaron los fragmentos liberados mediante RP-HPLC-MS/MS. Aunque ambos péptidos se hidrolizaron parcialmente por las enzimas digestivas, los digeridos de los péptidos y algunos de sus fragmentos, como RY, LGY e YLGY, presentaron una potente actividad inhibidora de la ECA. La actividad antihipertensiva de los fragmentos mayoritarios de RYLGY, concretamente, RYLG, YLGY e YLG, fue moderada. Por otra parte, mediante los estudios con células Caco-2 y HT29-MTX-6, se pudo concluir que los péptidos RYLGY y AYFYPEL también se hidrolizaron por las peptidasas celulares, siendo el péptido RYLGY más susceptible a esta actividad y liberándose el fragmento YLGY, mayoritariamente. Sin embargo, ambos péptidos intactos y algunos de sus fragmentos pueden ser transportados a través de la monocapa de células Caco-2, HT29-MTX-6 y el co-cultivo Caco-2/HT29-MTX (3:1), siendo su absorción mayor a través de HT29-MTX-6. En el sexto apartado, se aplicó la metodología de superficie de respuesta para evaluar los efectos de las principales variables implicadas en el proceso de hidrólisis de un concentrado de proteínas de suero comercial con Corolase® Se ha podido concluir que la caseína es un sustrato excelente para la preparación de hidrolizados con actividad inhibidora de la ECA in vitro y propiedades antihipertensivas en SHR. Más allá de su alto valor nutritivo, el empleo de caseína y de proteínas de suero para la preparación de hidrolizados que puedan ejercer un efecto beneficioso para la salud, supone un nueva vía de aprovechamiento y revalorización de la leche y, concretamente, de estos productos. PP y termolisina. Mediante la aplicación de un diseño factorial completo, se evaluó la relación de enzima/sustrato y el tiempo de hidrólisis, obteniéndose la mayor actividad inhibidora de la ECA y antioxidante con el empleo de termolisina. Posteriormente, para estudiar simultáneamente el efecto de las variables anteriores y la temperatura sobre la actividad antioxidante, se empleó un modelo central compuesto circunscrito. Se observó que las tres variables afectaban a la actividad antioxidante. Además, se han obtenido hidrolizados con una potente actividad antioxidante, tan efectivos como el BHA, y se han identificado los péptidos mayoritarios mediante RP-HPLC-MS/MS.

Los principales resultados de esta Tesis están protegidos por dos solicitudes de Patente Internacional PCT/ES2006/070079 y PCT/EP2010/055924. El desarrollo del ingrediente funcional a escala industrial se ha llevado a cabo en nuestro laboratorio conjuntamente con una empresa del sector alimentario, que ha licenciado estas patentes. Dado el carácter protegido de algunos de estos resultados y por exigencias de confidencialidad, en la presente Tesis sólo se recogen algunos de los resultados más relevantes.