Valoración de una técnica de PCR anidada en la detección de Mycobacterium avium subsp paratuberculosis en muestras de tejido incluído en parafina de ovinos infectados experimentalmente

Abstract

Los animales infectados por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), agente causal de la paratuberculosis de los rumiantes, pueden mostrar diferentes formas lesionales, relacionadas con la fase de la infección y la respuesta inmune. En las lesiones de carácter focal, asociadas a fases iniciales o de latencia, y caracterizadas por la presencia de pequeños granulomas localizados en el tejido linfoide intestinal o nódulos linfáticos mesentéricos, es habitual no detectar bacterias, o hacerlo en número muy bajo, utilizando métodos de tinción convencionales. El objetivo de este trabajo es la valoración, en secciones de tejido fijado en formol e incluido en parafina, de tres técnicas diferentes para detectar Map: tinción de Ziehl-Neelsen (ZN), técnica inmunohistoquímica (IHQ) y PCR anidada. Este último método difiere de la PCR convencional en que, sobre el producto de PCR obtenido, se lleva a cabo una segunda amplificación. Se emplearon muestras de válvula ileocecal (VIC), íleon (IL), placa de Peyer yeyunal (PPY) y nódulo linfático mesentérico (NLM), procedentes de 38 ovejas y corderos infectados experimentalmente por Map, con diferentes formas lesionales, así como 6 animales control. La PCR anidada resultó ser la técnica más sensible, detectando entre el 46,1 y 100% de animales con lesiones focales, y el 80-100% con lesiones multifocales más avanzadas, según el órgano estudiado. Además, fue la única técnica capaz de confirmar la presencia de Map en aquellos animales infectados que no desarrollaron lesiones granulomatosas, hasta un máximo de 47,6% de los casos en VIC. En cambio, generalmente, el ZN y la IHQ detectaron un número ligeramente mayor de animales con lesiones multifocales, caracterizadas por presentar cantidades significativas de Map. Los controles fueron negativos para cada técnica. La técnica de la PCR anidada, en tejido incluido en parafina, sería un buen candidato como método de diagnóstico en aquellas lesiones donde, o bien la cantidad de Map es demasiado baja, o Map se presentaría como formas defectuosas en su pared, que no podrían ser visualizadas mediante técnicas tintoriales. No obstante, se trata de una técnica muy laboriosa, en cuya ejecución deben tomarse numerosas precauciones para evitar contaminaciones.