Development of genetic circuits and synthetic receptors in Escherichia coli for detecting tumor-associated metabolites and protein antigens

Abstract

[EN] Anaerobic and facultative bacteria are promising tools in the treatment of cancer since they are able to colonize solid tumors, proliferating in the tumor microenvironment characterized by hypoxic and immunosuppressive conditions, with metabolite gradients that differ from healthy homeostatic concentrations. Due to their active motility, bacteria can also reach tumor regions that cannot be accessed by passive therapeutics. With the advances in synthetic biology, researchers are engineering bacteria to produce different proteins with cytotoxic and immunomodulatory activities within the tumor. In order to increase the safety of bacterial therapies the induction of these activities requires specificity to avoid enacting their effects outside the tumor. In this PhD thesis we have aimed to develop inductions systems that avoid relying in classical chemical inducers and focus on detecting specific tumor cues such as tumor-associated metabolites and proteins, as well as genetic circuit tools to program a more specific response to those signals. We have characterized several promoters that respond to increased concentrations of L-lactate, reactive oxygen species and nitric oxide (NO), which are common characteristic of the tumor microenvironment. Promoters were analyzed by using gfp as reporter gene while integrated in the chromosome of E. coli K-12, with two NO promoters (PnorV and Phmp) showing good characteristics for in vivo applications and a L-lactate promoter (a mutated version of PlldP) presenting promising results that could be further improved. Next, we tested the possibility of using serine integrases to design genetic logic circuits and generate genetic memory using targets placed in the chromosome of E. coli. We found that three different serine integrases (Bxb1, Tp901 and Int7) can successfully catalyze the excision and inversion of chromosome-integrated targets, with excision appearing more efficient. Bxb1 and Tp901 targets were used to produce functional AND logic circuits based on excision or inversion. The NO-responsive Phmp promoter and Bxb1 were used to create a NO biosensor E. coli that generates genetic memory after exposure, with all the genetic elements integrated in the chromosome of E. coli. Detection of tumor-associated proteins could also allow the specific activation of therapeutic bacteria. Previous works from our laboratory engineered E. coli cell surface display systems based on protein fusions between single-domain antibodies (nanobodies) and the b-barrel domain of outer membrane proteins (OMPs) belonging to the type V secretion system (T5SS). Building from those results, in this work we engineered different types of chimeric OMP receptors, based on the b-barrel of T5SS proteins such as intimin, invasin and EhaA, which simultaneously display a nanobody on the bacterial cell surface and protein fragments of a reporter system in the bacterial periplasm. We obtained functional chimeric proteins that display a nanobody binding the human epidermal growth factor receptor (EGFR), a tumor-associated antigen, and that express in the periplasm the two fragments of a split luciferase reporter (NanoBiT) or peptides for covalent protein fusions (SpyTag and SnoopTag). By co-expressing intiminand invasin-based chimeric receptors having the anti-EGFR nanobody and the NanoBiT fragments, we have demonstrated that E. coli bacteria can function as a biosensor, decreasing its bioluminescence signal in the presence of soluble EGFR and in a dosedependent manner. Given the modularity of these chimeric proteins, these results open the way to generate bacterial antigen receptors (BAR) for biosensors detecting multiple extracellular protein antigens associated to human diseases (infection, inflammation, cancer) as well as the presence of toxins and pathogens in environmental samples.

[ES] Las bacterias anaeróbicas y facultativas son prometedoras herramientas en el tratamiento del cáncer dada su capacidad para colonizar tumores sólidos, proliferando en un microambiente tumoral caracterizado por condiciones hipóxicas e inmunosupresoras y gradientes de metabolitos que difieren de las concentraciones homeostáticas sanas. Debido a su movilidad activa, las bacterias también son capaces de alcanzar regiones tumorales a las que las terapias pasivas no pueden acceder. Gracias a los avances en biología sintética, se están diseñando bacterias capaces de producir diferentes proteínas con actividades citotóxicas e inmunomoduladoras desde el interior del tumor. Para incrementar la seguridad de las terapias bacterianas la inducción de estas actividades requiere una alta especificidad que evite que sus efectos puedan manifestarse fuera del tumor. En la presente tesis doctoral hemos trabajado en el desarrollo de sistemas de inducción que eviten la necesidad de utilizar inductores químicos clásicos y en cambio se basen en la detección de señales específicas del tumor, como son la presencia de altos niveles de metabolitos y proteínas asociadas al ambiente tumoral. Además, también se han desarrollado circuitos genéticos destinados a programar una respuesta más específica a dichas señales. En primer lugar, caracterizamos promotores que responden a altas concentraciones de L-lactato, especies reactivas de oxígeno y óxido nítrico (NO), características comunes del microambiente tumoral. Los promotores fueron analizados usando gfp como gen reportero estando integrados en el cromosoma de E. coli K-12. Dos promotores sensibles a NO (PnorV and Phmp) demostraron buenas características para su uso en aplicaciones in vivo y un promotor sensible a L-lactato (una versión mutada de PlldP) presentó resultados prometedores que podrían ser mejorados en el futuro. A continuación, estudiamos la posibilidad de usar serin-integrasas para diseñar circuitos genéticos lógicos y generar memoria genética usando dianas situadas en el cromosoma de E. coli. Determinamos que tres serin-integrasas distintas (Bxb1, Tp901 y Int7) pueden catalizar la excisión e inversión de dianas integradas en el cromosoma, con una mayor eficiencia en el caso de la excisión. Empleando dianas para Bxb1 y Tp901 se diseñaron circuitos lógicos tipo AND funcionales basados tanto en la excisión como en la inversión. Mediante el control de la expresión de Bxb1 por el promotor sensible a NO Phmp se generó una cepa de E. coli biosensora de NO que genera memoria genética tras la exposición a dicha molécula, con todos los componentes genéticos integrados en el cromosoma de la bacteria. La detección de proteínas asociadas a tumores también podría permitir una activación especifica de bacterias terapéuticas. En trabajos previos de nuestro laboratorio se diseñaron sistemas de presentación en la membrana de E. coli basados en fusiones proteicas entre anticuerpos de dominio único (nanoanticuerpos o nanobodies) y el dominio barril  de proteínas de membrana externa (OMPs) pertenecientes al sistema de secreción tipo V (T5SS). Partiendo de estos resultados, en este trabajo hemos generado diferentes tipos de receptores basados en OMP quiméricas utilizando el dominio barril  de proteínas del T5SS como intimina, invasina y EhaA, capaces de presentar simultáneamente un nanoanticuerpo en la superficie bacteriana y un fragmento proteico de un sistema reportero en el periplasma bacteriano. Se produjeron proteínas quiméricas funcionales que presentan un nanoanticuerpo capaz de unirse al factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR), un antígeno asociado a tumores, y que expresan en el periplasma los fragmentos complementarios del sistema reportero NanoBiT, basado en una luciferasa fragmentada, o los péptidos de los sistemas SpyTag y SnoopTag, que permiten fusiones covalentes a otras proteínas. Mediante la expresión simultánea de los receptores quiméricos basados en intimina e invasina con el nanoanticuerpo contra EGFR y los fragmentos de NanoBiT hemos demostrado que la bacteria E. coli puede funcionar como un biosensor, disminuyendo su señal bioluminiscente en la presencia de EGFR soluble de manera dosis-dependiente. Dada la naturaleza modular de estas proteínas quiméricas, estos resultados abren la puerta a generar receptores bacterianos de antígeno (BAR, bacterial antigen receptors) para la creación de biosensores capaces de detectar múltiples proteínas extracelulares asociadas a enfermedades humanas (infecciones, inflamación, cáncer) así como la presencia de toxinas y patógenos en muestras ambientales.