Transformación genética de embriones somáticos castaño mediante cocultivo con Agrobacterium tumefaciens: factores que afectan a la transformación y regeneración

Abstract

La mejora vegetal convencional en especies forestales es un proceso lento debido en gran medida a la propia biología de los árboles (crecimiento lento, floración tardía, elevado grado de heterozigosis, etc.). Las técnicas de biología molecular como la transformación genética podrían acelerar los programas de mejora de las especies forestales, puesto que entre sus aplicaciones potenciales se incluyen la producción de árboles con un menor contenido en lignina, con una mejor calidad de madera, con floración precoz o con resistencia a herbicidas, plagas y enfermedades. El castaño es una especie amenazada por el ataque de dos enfermedades fúngicas (la tinta y el chancro) que han hecho desaparecer millones de árboles tanto en Europa como en Estados Unidos. Aunque no se conocen los mecanismos de defensa para estas enfermedades, se podrían transferir genes que confieran algún tipo de resistencia antifúngica, como pueden ser los genes que codifican osmotinas y quitinasas. Sin embargo, para ello es necesario disponer de sistemas eficaces de regeneración y transformación genética. Recientemente, se han obtenido por primera vez embriones somáticos y plantas transgénicas de castaño con genes marcadores mediante co-cultivo con Agrobaclerium lumefaciens (Corredoira el al., 2004). El objetivo del presente trabajo consiste en la optimización del protocolo de transformación desarrollado para embriones somáticos de castaño. Los explantos (grupos de 2-3 embriones somáticos en estado globular-cotiledonar temprano) se co-cultivaron durante 4 días con la cepa de Agrobacleriwn IlImefaciens EHA l 05 transformada con el vector binario pUbiGUSINT (Humara el al., 1999) que porta el gen de la neomicina fosfotransferasa II (npllI) como marcador seleccionable y el gen de la glucuronidasa (l/idA) como gen informador. Se evaluaron factores como la densidad óptica del cultivo bacteriano (0.3; 0.6; Y 0.9), la integridad fisica de los embriones somáticos (dañado o no dañado mediante pinchazo) y el genotipo de las líneas embriogénicas (cuatro de origen zigótico y una de origen foliar). Los mejores resultados se obtuvieron cuando los embriones somáticos no dañados se infectaron con una suspensión bacteriana de una D0600nm= 0.6. Por otro lado, cuando se evaluó la capacidad de transformación de diferentes líneas embriogénicas se comprobó que existían diferencias genotípicas en la frecuencia de transformación, observándose líneas embriogénicas con alta capacidad de transformación (33.8 %) Y líneas embriogénicas con baja capacidad de transformación (1. 7 %). Mediante PCR y Southem blot se comprobó la transformación genética de las líneas que mostraron crecimiento en medio de selección con kanamicina (150 mgll) y que dieron positivo en la prueba GUS, observándose la presencia de ambos genes en todas las líneas embriogénicas evaluadas