Identificación de factores de virulencia determinantes de necrosis en infecciones compatibles planta-virus y su papel en la respuesta a estreses abióticos asociados al cambio climático

Abstract

[EN] This PhD Thesis exposes and discusses research work consisting ofn the next following topics: i) the viral factor responsible for systemic necrosis elicited during viral synergistic interactions between PVX (Potato virus X, a potexvirus) and viruses belonging to Potyvirus genus, and ii) the effect of environmental stresses associated to climate change, like such as high levels of CO2 in the atmosphere ([CO2]), elevated temperatures (T) or drought, on the outcome of compatible plant-virus interactions, on single or mixed infections, with viruses taking part in the PVX-potyvirus interaction that was mentioned above, or chimeric viruses deriving from them. Mixed infections in a compatible host are common phenomena in nature; in fact, they are the rule rather than the exception. A number of different viral interactions can take place when several viruses are established in the same host. These interactions have epidemiological and pathological implications that are poorly characterized, frequently unpredictable, and largely influenced by environmental factors. Among these environmental factors are just [CO2] in the atmosphere, T and water availability, whose values are continuously being modified as a result of human activities and the associated global warming. One of these interactions, the viral synergism, usually lead to increased viral titre of one of the viruses during mixed infections; in addition, this synergism usually is accompanied by increased levels of severity ofin symptoms, higher more severe than those observed in single infections with each of the viruses, a phenomenon also known as synergism in pathology. One of the most extreme symptoms induced byelicited under these synergistic infections is systemic necrosis (SN). PVX-potyvirus is a classical synergistic pair following this behaviour in the susceptible host Nicotiana tabacum. This synergism leads to remarkably increased viral titres of PVX in the presence of the potyvirus, in comparison with single infection, remaining the potyvirus unchanged, and eliciting SN. This increased level of PVX has been attributed to the HC factor (HCPro, Helper component proteinase) deriving derived from potyviruses; HC acts as a viral suppressor of the RNA silencing (VSR) mediated by small RNAs. This type of gene silencing is the main mechanism involved in plant defence against viruses; RNA silencing acts promoting the degradation of targeted RNA decay, avoiding its generation or precluding its gene expression. PVX titres could be enhances. The presence of HC could also enhance PVX titres as a result of its suppressor activity.

Nevertheless, in Nicotiana benthamiana, another susceptible host, synergism in pathology induced by PVX-potyviruses is not followed byassociated with increased viral titres. Many different synergistic interactions apart from the one mentioned above show increases in severity of symptoms that are not followed accompanied by increases in viral titres, apart from the one mentioned before. So, all of these observations call into question that enhanced virulence associated with synergistic interactions is the consequence of an increase a direct role for increased in viral titres in the higher virulence observed for synergistic interactions. Chimeric forms of PVX with expressing VSR deriving derived from potyviruses (PVX-HC) are able to induce the synergism in pathology observed for in mixed infections with PVX-potyvirus infections, which point out to this potyviral factor as necessary and sufficient to induce SN. At the same time, the behaviour of these chimeric viruses suggests the presence of one or more pathogenicity factors codified encoded by PVX, which are able to induce necrosis when their activities are enhanced by potyviral HC during PVX-potyvirus mixed infections. The first objective of the present thesis has been the isolation of the factor(s) codified encoded by PVX responsible for SN. In order to do so, it was attempted to reproduce at local level the necrotic response elicited by PVX-potyvirus, by co-expressing PVX together with HC from PPV (Plum pox potyvirus), in N. benthamiana. In agroinfiltrated patches, PVX was able to induced necrosis in the presence of this VSR in trans, in agroinfiltrated patches. The necrotic response was analyzed in samples of taken from agroinfiltrated tissue, by measuring electrolyte leakage, and by histochemical staining sensitive toindicative of the generation of oxygen reactive species (ROS). Northern blot Aanalyseis done by northern blotting of the accumulation of the different PVX RNAs, i. e., genomic RNA (gRNA) and subgenomic RNAs (sgRNAs), in the presence of HC, showed identified the sgRNAs as the main targets being affected by the VSR activity of HC; the potyviral factor stabilized or increased sgRNA levels. This behaviour effect was also confirmed at systemic level, in the context of a PVX-PPV synergistic interaction. One of the sgRNAs whose level was stabilized was sgRNA1. This sgRNA1 codify encodes for the P25 protein (TGB1, Triple gene block 1). P25, behaves as a multifunctional protein, is involved in replication, intracellular and cell-to-cell movement into the cell and between cells, and, as the PVX VSR, is responsible for suppressing suppression of gene silencing, as the PVX VSR. When P25 was expressed individually, in the presence of HC or together with other non-potyviral VSRs, a necrotic response was induced in N. benthamiana and N. tabacum. This necrosis was also P25 dose-dependent.

In order to analyze if P25 can induce necrosis in the context of a potyviral infection, in systemic locations, a PPV-derived vector was modified to include the P25 ORF (PPV-P25 chimera). PPV-P25 was able to produce necrotic foci and to induce a general worsening of symptoms, when compared with single PPV-infected plants. To discard the contribution of PVX proteins other than P25 in eliciting necrosis with potyviral HC, a PVXΔP25 mutant was obtained. This mutant expresses a non-functional P25 protein, deleted at the C-terminusal. Simultaneous agroinfiltration of PVXΔP25 together with HC was not able to induce necrosis, as was wild type PVX wild type with HC. So, P25 arises as the main pathogenicity factor responsible for necrosis in PVX-associated synergisms. In the context of a PVX-PPV synergistic interaction, the VSR activity of HC stabilizes the level of accumulation of PVX sgRNA1 level, which could lead to higher levels of P25 in the cell, and in turn eliciting SN. necrotic symptoms By using different mutant forms of P25 mutants, the suppressor activity of this factor seemed to be associated with the ability of P25 to elicit necrosiswas found indispensable for eliciting necrosis. The suppressor activity of P25 was estimated by measuring the effects of this VSR over on the accumulation of a reporter GFP proteinmRNA, when the VSR and the reporter protein are were co-agroinfiltrated. Also, the involvement of factors like SGT1 (de Suppressor of the G2 allele of SKP1) and RAR1 (de Required for MLA12 resistance 1) in the induction of SN responses was analyzed by virus-induced gene silencing (VIGS). These two factors are associated to with the hypersensitive response (HR). These silencing studies demonstrated that both HR and SN are executed through mechanisms involving shared factors like RAR1 and SGT1. So, these results suggest the existence of a putative resistance (R) factor responsible for recognizing P25 as an avirulence (Avr) factor. However, tThisese possibility isfindings are compatible with other explanations. In this regard, the accumulation of misfolded proteins in the endoplasmatic reticulum (ER), whose modification and rearrangement is are induced by P25, could induce the activation of the ‘unfolded protein response’ (UPR), leading to necrosis when this stress is not resolved.

The rising [CO2] in the atmosphere, and the increasing associated T associated, are responsible for a global warming whose effects may be magnified in the future. In 2100, IPCC (Intergovernmental panel on climate change) predicts a [CO2] in the atmosphere of around 1000 ppm, compared with the current 400 ppm, which may lead to increases of 3-4ºC in average global temperatures. Because of this reason, it is important to analyze model plant-virus interactions under environmental parameters associated to climate change. Regarding to the effects of these environmental factors in the outcome of synergistic interactions, no analysis has been previously carried out until the present work. In this thesis, N. benthamiana plants infected with PVX, PPV or the mixed infection with PVX-PPV, were analyzed under a 970 ppm CO2-enriched atmosphere, and were compared with the onesplants kept at usual standard concentrations of 401 ppm; in addition, the same kind of infections were analyzed at temperatures of 30ºC, and were also compared with the ones kept at usual standard temperatures of 25ºC. Elevated [CO2] led to decreased levels of virulence in single infections, while the virulence of mixed synergistic infections remained unchanged, when compared with the corresponding infections at standardusual [CO2]. Virulence was estimated in these works through electrolyte leakage measurements and histochemical staining sensitive toindicative of ROS production. The effects of the CO2-enriched atmosphere had heterogeneous effects on viral titres varied among infections; these viral titres were measured, as revealed by quantitative PCR and northern blot assaysanalyses. High T led to decreased levels of virulence and viral titres in plants single singly infected with PPV, and in mixed infections with PVX-PPV infections, when compared with infections kept at usualstandard T. Unlike the others, virulence of single infection byof PVX single infection remained unchanged, even though this environmental abiotic stress reduced PVX viral titre. Afterwards that, the necrogenic property of P25 in combination with HC from PPV was studied under these newvariable environmental conditions. P25-induced necrosis was reduced at higher [CO2] levels, and conversely elevated T led to an earlier and increased expression of necrosis. This higher necrotic potential of P25 at elevated T could explain why PVX virulence remained unchanged under the same conditions, even though with a decreased viral titres were decreased. When the suppressor activity of P25 was analyzed, no differences were observed it was not observed any difference under the examined environmental conditions examined. These results point out mechanisms other than gene silencing in modulating viral accumulation and P25-induced necrosis under higher [CO2] or elevated T. Anyway, these observations indicate a differential behaviour of single infections versus mixed synergistic ones under each of these environmental factors. Because of climate change, a higher frequency of mixed infections is expected in the future; so, the exposed aforementioned differential behaviourdifferences on virulence may have pathological and epidemiological relevance.

Drought is a common abiotic stress affecting crops, whose detrimental effects may be worse in the future. IPCC predicts for 2100 a higher frequency and intensity of extreme phenomena, like long periods of drought, in 2100, as a result of a much more unstable climatological system in a warmer world. Metabolic and hormonal changes in the host produced by viral infections can potentially modify its responses to subsequent drought stress. In order to explore these possibilities, in the present work N. benthamiana and Arabidopsis thaliana were used as model hosts. These plants were mock- or virus-inoculated or inoculated with the viruses analyzed mentioned above, and subjected to different degrees of water deprivation. The level of tolerance to drought exhibited by these plants was estimated based mainly on water (%) content measurements, relative to dry total weight. Reproductive or biological efficiency (fitness) was estimated through seed production and the number of these plants producing seeds. Stress responses to viral infections were studied by determining the accumulation of secondary metabolites and the photosynthetic efficiency, parameters that were analyzed by fluorescence analysis. Transpiration rates (through dehydration curves, thermography and stomatal conductance) and morphological parameters (stomata number, stomatal index and root architecture) were also determined in these plants, looking forto seek correlations between these parameters and changes in tolerance valuesto drought. In A. thaliana, metabolic and hormonal changes associated to with infection and to with different water regimes were also analyzed; these water regimes were: watered plants, plants subjected to moderated drought or to extended drought, and plants rewatered after this a period of extended drought. In addition, the role of hormonal regulation in enhanced tolerance to drought stress was analyzed by using A. thaliana and N. benthamiana mutant plants infected with PPV-P25.

All virus-inoculated infected plants exhibited higher tolerance levels to drought than mock-inoculated plants, in both A. thaliana and N. benthamiana, although to different extent. Plants infected with the most virulent infections showed the higher highest tolerance levels to drought, that is, infections by PPV-P25 and PVX-PPV infections in N. benthamiana and infection by PPV-P25 infection in A. thaliana. In spite of this increased tolerance, the most virulent infections did not exhibit confer an increased fitness to the host. In A. thaliana, only infections with moderate virulence led to higher fitness in drought- stressed plants, when compared with mock-inoculated plants. All of these data suggest that increased fitness cannot be inferred directly from an increase in thed level of tolerance to drought levels, because a probable negative contribution of virulence should be taken into account. In addition, the increases in fitness caused by virus infection are is host-dependent. In N. benthamiana, higher levels of tolerance to drought stress in virus-infected plants may might be related with reduced transpiration rates, as was observed for virus-infected plants. However, in A. thaliana an increase of transpiration rates was observed under upon viral infection, which probably rules out a direct contribution of this parameter to drought tolerance in this host. These results also suggest that tolerance induced by viral infection may be executed through different mechanisms in these two experimental hosts, at least with regardsing to transpiration. A. thaliana accumulates protective metabolites like sugars, polyamins and amino acids under stresses induced by water deficit. All these compounds decrease water potential, which in turn makes it easier for the plant to uptake water from the substrate. These compounds are also involved in ROS detoxification and the stabilization of cell structures during dehydration processes. In the metabolic profiling analysis carried out in the present work, A. thaliana accumulated galactinol, tryptophan, fructose orand proline as relevant drought stress-induced compounds. Water regime was the main parameter determining metabolic shifting among samples, and more important than viral infection. Nevertheless, infected plants showed high levels of these compounds even before being subjected to water deprivation; moreover, these levels of these metabolites were higher in plants with the most virulent infection, i. e., PPV-P25. The altered metabolic status of differentiated status of these PPV-P25-infected plants was also evident when a hierarchical clustering analysis was done over the entire metabolic dataset. Infections with this chimeric virus led to high accumulation levels of some prominent protective compounds like putrescine. So, the metabolic acclimation prior to water deprivation may be responsible for the increased tolerance to drought stress exhibited by virus-infected A. thaliana, which is more evident in PPV-P25-infected plants. Viral infections also led toconferred a differentiated differential hormonal status in A. thaliana, subjected to among the distinct water regimes analyzed. In general, an increase of abscisic acid (ABA) content followed the worsening of drought stress symptoms in mock-inoculated plants. This increase in ABA was not observed for in virus-infected plants; instead, they showed elevated levels of salicylic acid (SA). This observation is in line with the antagonistic interaction proposed for SA-ABA. A. thaliana and N. benthamiana mutant plants defective for SA synthesis or accumulation did not show enhanced tolerance to drought when they were infected by PPV-P25. SoTherefore, the increased higher levels of tolerance to drought induced by virus infection could be mediated by SA the hormone SA in these two experimental hosts.

[ES] La presente Tesis Doctoral expone y discute una serie de trabajos en los que se estudia, por una parte, el factor vírico responsable de la inducción de necrosis en la interacción sinérgica que se da entre el virus PVX (de Potato virus X, un potexvirus) y virus del género Potyvirus; por otra parte, se analiza el efecto de diversos estreses ambientales asociados al cambio climático, como son la elevada concentración de CO2 en la atmósfera ([CO2]), el aumento de la temperatura (T) y la sequía, sobre el resultado de la interacción compatible planta-virus, en infecciones sencillas o mixtas, con los virus participantes en la interacción PVX-potyvirus mencionada más arriba, o con quimeras derivadas de ellos. Las infecciones múltiples de virus en un hospedador compatible son habituales en la naturaleza; de hecho, constituyen más bien la norma. Cuando más de un virus se establece en un mismo hospedador, pueden tener lugar una serie de interacciones que, en su mayoría, presentan implicaciones epidemiológicas y patológicas pobremente caracterizadas, frecuentemente imprevisibles, y ampliamente dependiente de factores ambientales. Entre estos factores ambientales se encuentran precisamente la [CO2] en la atmósfera, la T y la disponibilidad de agua, cuyos valores se encuentran en permanente cambio como consecuencia del calentamiento global. Una de estas interacciones víricas, el sinergismo viral, suele conducir a un incremento en la acumulación de uno de los virus durante la infección mixta; además, este sinergismo suele ir acompañado de unos síntomas mucho más graves que aquellos que siguen aprovocados por las infecciones sencillas, con cada uno de los virus por separado, lo que se conoce también como sinergismo en patología. Uno de los síntomas más extremos se corresponde con la aparición de necrosis sistémica (SN). PVX-potyvirus constituye un par sinérgico que cumple esta pauta de comportamiento en un hospedador susceptible como es Nicotiana tabacum. En este sinergismo, PVX incrementa de forma notable su acumulación en presencia del potyvirus, en relación a la infección sencilla, y va acompañado de la aparición de SN. Esta incremento se ha relacionado con el factor HC (de HCPro, Helper component proteinase) derivado de potyvirus, el cual es una proteína que actúa como supresor del silenciamiento génico mediado por pequeños RNAs, o VSR (de Viral suppressor of RNA silencing). Estae variante del silenciamiento génico es una de las principales respuestas defensivas en plantas frente a las infecciones por virus, cuya misión es degradar el RNA viral, impedir su generación o evitar su expresión. En presencia de HC, la supresión del silenciamiento potenciaría en la planta la acumulación de PVX.

Sin embargo, en otro huésped susceptible, como es Nicotiana benthamiana, el sinergismo en patología de PVX-potyvirus no va acompañado de un incremento en la carga viral. En muchos otros casos de sinergismos en patología tampoco se observa un incremento en la acumulación de ninguno de los virus. Por tanto, estas observaciones, en general, permiten cuestionar una conexión directa entre mayor virulencia y acumulación viral en este tipo de interacciones sinérgicas. Las quimeras de PVX portadoras del VSR de potyvirus (PVX-HC) son capaces de reproducir el sinergismo en patología observado en las infecciones mixtas PVX-potyvirus, lo que señala a este factor potyviral como suficiente y necesario para la manifestación de la SN. Estas quimeras, a su vez, sugieren la existencia de uno o más factores en PVX con capacidad para inducir necrosis cuando su acción es potenciada en presencia del HC potyviral, durante la infección mixta PVX-potyvirus. El primer objetivo de la presente tesis ha sido determinar el factor o factores de PVX responsables últimos de la inducción de SN. Para ello, se intentó reproducir a nivel local la necrosis inducida por PVX-potyvirus, co-expresando PVX junto con HC de PPV (de Plum pox potyvirus) en N. benthamiana. PVX, en presencia de este VSR en trans, fue capaz de inducir necrosis en los parches agroinfiltrados. Esta necrosis se analizó a través de medidas de liberación de electrolitos y tinciones histoquímicas sensibles aindicativas de la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS, de Reactive oxygen species), en muestras de tejido agroinfiltrado. El análisis mediante northern blot de la acumulación de los RNAs de PVX, genómico (gRNA) y subgenómicos (sgRNAs), en presencia de HC, puso de manifiesto que la actividad de este VSR afecta preferentemente al nivel de acumulación de estos últimos, estabilizándolo o incrementándolo. Este efecto también fue confirmado a nivel sistémico, en el contexto de la interacción sinérgica PVX-PPV. Uno de los sgRNAs afectados, el sgRNA1 de PVX, codifica la proteína P25 (TGB1, de Triple gene block 1). P25 es una proteína multifunción con participación en procesos tales como replicación, movimiento dentro de la célula y entre células, y supresión del silenciamiento génico, como VSR de PVX. La expresión aislada de P25, en presencia de HC, o de otros VSRs no potyvirales, fue suficiente para inducir necrosis tanto en N. benthamiana como en N. tabacum. Además, esta necrosis fue dependiente de dosis de P25.

Para determinar si P25 induce necrosis de forma sistémicaen un contexto de infección con potyvirus, se empleó un vector derivado del virus PPV modificado para incluir la ORF de P25 (quimera PPV-P25). PPV-P25 fue capaz de originar focos necróticos a nivel sistémico, aparte de ocasionar un empeoramiento general de los síntomas, en comparación con plantas infectadas con PPV. Para descartar la contribución de cualquier otra proteína distinta a P25 en la necrosis producida por PVX en presencia de HC, se hizo uso del mutante PVXΔP25, el cual expresa una forma no funcional de P25, delecionada en posición C-terminal. La agroinfiltración simultánea de PVXΔP25 con HC no fue capaz de inducir necrosis, al contrario que la agroinfiltración de PVX silvestre con HC. De este modo, P25 emerge como el principal determinante de patogenicidad responsable de la necrosis observada en los sinergismos asociados a PVX. En la interacción PVX-PPV, la actividad de HC como VSR estabilizaría los niveles de acumulación del sgRNA1 de PVX, y por tanto podría incrementar los niveles de P25, ocasionando SN. El empleo de diversas formas mutadas de P25 puso de manifiesto que la actividad supresora de este VSR es necesariaparece estar asociada a la capacidad de P25 para la induccirión de necrosis. Esta actividad supresora se determinó a través del efecto que P25 ejerce sobre los niveles de acumulación del mRNA de una proteína reportera, como es GFP, cuando se agroinfiltran simultáneamente. También, mediante estudios de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS, de Virus-induced gene silencing) de SGT1 (de Suppressor of the G2 allele of SKP1) y RAR1 (de Required for MLA12 resistance 1), factores asociados a la respuesta hipersensible (HR, de Hypersensitive response), se puso de manifiesto que la necrosis inducida por P25 se ejecuta a través de rutas comunes con esta respuesta, lo que sugiere la existencia de un factor de resistencia R implicado en el reconocimiento de P25 como factor de avirulencia Avr. Esta posibilidad, sin embargo, no descarta otras como que la necrosis sea debida a una respuesta de estrés en el retículo a proteína mal plegada (UPR, de Unfolded protein response), como consecuencia de la remodelación a la que esta estructuraeste orgánulo celular se encuentra sometida por la acción de P25. El incremento constante de la concentración de CO2 en la atmósfera, y el aumento de T asociado al mismo, son responsables de un cambio climáticocalentamiento global cuyas consecuencias seguramente se vean agudizadas en el futuro. Según el IPCC (de Intergovernmental panel on climate change), en el año 2100 se podría alcanzar una [CO2] en la atmósfera de hasta 1000 ppm, en relación a las 400 ppm actuales, lo que iría ligado a incrementos de la temperatura media del planeta de 3-4ºC. Por todo ello, es relevante el estudio de interacciones planta-virus modelo en escenarios que contemplen variables asociadas al cambio climático. En cuanto al efecto de estos factores sobre el resultado de las interacciones sinérgicas, ningún análisis se ha realizado al respecto hasta el presente trabajo. En esta tesis, se analizaron plantas de N. benthamiana infectadas con PVX, PPV, o con la infección mixta PVX-PPV, bajo atmósferas con 970 ppm de CO2, en relación a los controles mantenidos a la concentración habitual de 401 ppm; también se analizaron las mismas infecciones a temperaturas de 30ºC, en relación a los controles mantenidos a la temperatura habitual dea 25ºC.

La elevada [CO2] ocasionó una disminución de la virulencia solo en las infecciones sencillas, mientras que en las mixtas no se observaron variaciones a este respecto, en relación a las infecciones a la [CO2] habitual. La virulencia se estimó a través de la liberación de electrolitos y de tinciones histoquímicas indicativas de la producción de sensibles a ROS. La atmósfera enriquecida en CO2 presentó también efectos dispares sobre la carga viral, analizada mediante northern blot y PCR cuantitativa. La alta T ocasionó una disminución de la virulencia y de la carga viral en la infección sencilla con PPV, y en la mixta con PVX-PPV, en relación a las infecciones analizadas a la T habitual. Para la infección sencilla con PVX, sin embargo, no se registró ningún cambio en la virulencia a elevada a T, pese a que este estrés sí determinó una reducción de la carga viral. Posteriormente, se estudió la capacidad necrogénica de P25 en estas condiciones ambientales, para lo que se agroinfiltró en presencia del factor HC de PPV. P25 indujo menos necrosis en elevada [CO2], mientras que la T la aumentó, y ocasionó una aparición más temprana de la misma. Esta mayor capacidad necrogénica de P25 a elevada T podría explicar la ausencia de cambios en la virulencia de PVX en estas mismas condiciones, pese a registrarse una menor carga viral. Cuando se analizó la actividad supresora de P25 no se observaron diferencias relevantes bajo la acción de ninguno de los dos estreses estudiados. Por tanto, otros procesos distintos al silenciamiento génico deben de estar operando bajo la elevada [CO2] o las altas T, modulando los niveles de acumulación viral y la necrosis inducida por P25. En cualquier caso, estos estudios apuntan a un comportamiento diferencial entre las infecciones sencillas y las infecciones mixtas bajo la acción de cada uno de estos factores ambientales. Debido al cambio climático, una mayor ocurrencia de infecciones mixtas es esperable en el futuro, por lo que este comportamiento diferencial podría acarrear importantes implicaciones epidemiológicas y patológicas.

Un estrés abiótico frecuente en cultivos, y cuyos efectos podrían agudizarse en numerosas regiones del planeta, es el correspondiente a la falta de agua. El IPCC contempla para el año 2100 un incremento en la frecuencia e intensidad de fenómenos extremos tales como sequías prolongadas, como consecuencia de un sistema climático más inestable en un mundo más cálido. Los cambios metabólicos y hormonales que ocasiona una infección en el hospedador pueden alterar su respuesta a un estrés por déficit hídrico sobrevenido. Para explorar esta posibilidad, en el presente trabajo de tesis se emplearon los hospedadores experimentales N. benthamiana y Arabidopsis thaliana, sanos o infectados con los virus analizados indicados más arriba, y sometidos a distintos grados de privación de agua. Se realizaron estimaciones de la tolerancia a la sequía medida como el contenido (%) en agua de la planta, en relación a su peso total. Se determinó la eficacia reproductiva a través del análisis de la producción de semillas y del número de plantas productoras de semillas por tratamiento. Una estimación de la virulencia inducción de respuestas de estrés ade las infecciones se realizó a través de sus efectos sobre la acumulación de metabolitos secundarios y sobre la eficiencia fotosintética, analizados mediante medidas de fluorescencia. También se realizaron análisis de transpiración (curvas de deshidratación, termografía y análisis conductimétricos) y de parámetros morfológicos (número de estomas, índice estomático y arquitectura radicular), con el objetivo de encontrar posibles correlaciones entre ellos y las variaciones observadas en la tolerancia a la sequía. En A. thaliana también se analizó la modificación del perfil metabolómico y hormonal sobre plantas sanas o infectadas, y sometidas a distintos tipos de regímenes hídricos. El papel de las hormonas en el incremento de la tolerancia al estrés hídrico se analizó mediante el empleo de mutantes de A. thaliana y N. benthamiana infectados con la quimera PPV-P25. Todas las infecciones incrementaron la tolerancia a la deshidratación en mayor o menor grado, en ambos hospedadores. Sin embargo, este efecto fue más intenso para las infecciones más virulentas, esto es para PPV-P25 y PVX-PPV en N. benthamiana, y para PPV-P25 en A. thaliana. Este incremento en la tolerancia no fue seguido, sin embargo, de una mayor eficacia biológica para las infecciones más virulentas. Sólo en A. thaliana, las infecciones de virulencia moderada fueron capaces de incrementar la eficacia biológica bajo estrés hídrico, en relación a los controleslas plantas no infectadosinfectadas. Estos datos sugieren que no debe inferirse una conexión directa entre un incremento en la tolerancia incrementada a la deshidratación en plantas infectadas con virus y mayor eficacia biológica, sin considerar una posible contribución negativa de la virulencia. Los incrementos en eficacia biológica son, además, dependientes de hospedador.

En N. benthamiana la mayor tolerancia a la deshidratación en plantas infectadas con virus podría relacionarse con el la menor grado tasa de transpiración observado observada en estas plantas cuando están infectadas. En el caso de A. thaliana, se determinó una mayor grado tasa de transpiración se determinó para en las plantas infectadas, por lo que este factor podría no ser relevante en este hospedador para la adquisición de tolerancia. Esto sugiere que la tolerancia a la deshidratación inducida por los virus podría residir sobre mecanismos esencialmente diferentes en ambos hospedadores. No sabemos cuanto contribuye la posible aclimatación metabolica en benthamiana a la tolerancia observada. Afirmación controvertida suavizala (terminando con “en lo que concierne a la transpiración “) o suprimela En A. thaliana, el estrés hídrico determina la acumulación de numerosos metabolitos protectores, como azúcares, poliaminas y aminoácidos. Estos compuestos reducen el potencial hídrico facilitando la adquisición de agua del sustrato, y están implicados en la desactivación de ROS y en la estabilización de estructuras celulares durante la deshidratación. En el análisis de perfiles metabólicos del presente estudio, se identificaron galactinol, triptófano, fructosa yo prolina, entre otros, como metabolitos destacados. El tipo de régimen hídrico al que fueron sometidas las plantas representó el principal efecto modulador sobre de el su perfil metabolómico, mayor que la infección viral. Sin embargo, las plantas infectadas, de forma previa a la exposición a la sequía, ya presentaban alterados los niveles de numerosos metabolitos, siendo esta alteración más notable en la infección más virulenta, PPV-P25. Este estado metabólico peculiar de las plantas infectadas con PPV-P25 también fue evidente mediante análisis de agrupamiento jerárquico realizado sobre los datos metabólicos. En este tipo de infección se acumularon compuestos protectores destacados como la putrescina. Esta aclimatación metabólica previa puede ser la responsable de la mayor tolerancia al estrés por sequía observado en A. thaliana bajo infección, efecto más pronunciado en la infección con PPV-P25. Las distintas infecciones también otorgaron a A. thaliana un estado hormonal diferenciado en los distintos regímenes hídricos estudiados. En general, el incremento en la acumulación de ácido abscísico (ABA) que se produjo en plantas sanas a medida que se incrementó el estrés hídrico, no fue observado en las plantas infectadas, las cuales sí acumularon ácido salicílico (SA). Esta observación está en consonancia con el comportamiento antagónico que se ha propuesto para la interacción SA-ABA. Los mutantes de A. thaliana y N. benthamiana afectados en la síntesis o en la acumulación de SA, infectados con PPV-P25, no mostraron una mayor tolerancia a la sequía. De este modo, el incremento en la tolerancia a sequía inducido por las infecciones virales podría parece estar medidado por la hormona SA en estos dos huéspedes.