Determinación de lípidos de interés clínico en muestras biológicas. Posibilidades analíticas de la fluorescencia de las flavoenzimas y de las técnicas cromatográficas combinadas

Abstract

La Química Analítica es uno de los pilares fundamentales de la Lipidómica, puesto que se encarga de desarrollar la metodología que posibilita la identificación y cuantificación de las diversas especies de lípidos en los sistemas biológicos. En base a esto, el trabajo de investigación desarrollado tuvo como objetivo fundamental el desarrollo de metodología analítica para la determinación en muestras biológicas de dos tipos de lípidos: fosfolípidos y esfingolípidos neutros. En cuanto a los fosfolípidos, su importancia biológica radica en que son los componentes mayoritarios de las membranas celulares. El trabajo se centró en la fosfatidilcolina. En el caso de los esfingolípidos neutros, la investigación se centró en determinados compuestos relacionados con ciertas enfermedades de depósito lisosomal: esfingomielina, glucosilceramida y globotriaosilceramida, potenciales biomarcadores de las enfermedades de Niemann-Pick, Gaucher y Fabry, respectivamente. Se diseñó un método basado en la combinación de enzimas fosfolipasas del tipo D y colina oxidasa para la determinación de fosfatidilcolina. La señal analítica del mismo procedía de la variación de intensidad de fluorescencia que experimentaba la enzima colina oxidasa en su reacción con la colina liberada en un paso previo de hidrólisis catalizado por la enzima fosfolipasa. El método permitió llevar a cabo con éxito la determinación selectiva de fosfatidilcolina en presencia de esfingomielina en muestras de plasma humano, obteniendo concentraciones similares a las ofrecidas por otros autores para el mismo analito. Con respecto a los esfingolípidos neutros, se diseñó una técnica hifenada basada en HPTLC con detección densitométrica FDIC (detección basada en cambios de intensidad de un fluoróforo) y espectrometría de masas. Esta fue aplicada con éxito a la determinación de SM en plasma humano, obteniendo valores del mismo orden de magnitud a los encontrados por otros autores en la determinación del mismo compuesto en muestras de plasma. Por otra parte, la técnica hifenada permitió separar y detectar en una muestra de plasma humano la globotriaosilceramida, compuesto que nunca antes se había conseguido resolver y detectar en cromatografía en capa fina.