Expresión recombinante de una RNA polimerasa bacteriana

Abstract

[EN] In cyanobacteria, transcriptional regulation of nitrogen metabolism-related genes is mainly mediated by the transcription factor NtcA. This transcription factor, which belongs to the CRP/FNR family, interacts with a consensus sequence in the promoter of the genes that regulates in order to recruit RNA polymerase (RNAP) to the transcription start site and activate transcription. The interaction mode and the mechanism by which NtcA activates RNAP is unknown. In very poor nitrogen conditions, NtcA is co-activated by the PipX protein. We know that this co-activation is partly due to PipX stabilization of the active form of NtcA, but we do not know if PipX also interacts with the RNAP and/or plays a role in its activation. The overall aim of the host group, specialized in determination of macromolecular structures is to study the transcription activation by the global nitrogen metabolism regulators NtcA and PipX by electron cryomicroscopy (cryo-EM), obtaining for this purpose the structure of these two proteins bound simultaneously to the RNAP and to a gene promoter. The current project is part of this aim, being its main objective to obtain three variants of a recombinant cyanobacteria Synechococcus elongatus RNAP in Escherichia coli, using polycistronic vectors, suitable for co-expression, that carry the genes that encode the different subunits of RNAP and subsequent purification. Furthermore, we have expressed and purified the proteins NtcA and PipX.

[ES] En cianobacterias, la regulación de la transcripción de genes relacionados con el metabolismo del nitrógeno está controlada, generalmente, por el factor de transcripción NtcA. Este factor de transcripción, perteneciente a la familia CRP/FNR, interacciona con una secuencia consenso en el promotor de los genes a los que regula a fin de reclutar a la RNA polimerasa (RNAP) al lugar de inicio de la transcripción y activarla. El modo de interacción y el mecanismo por el cual activa a la RNAP es desconocido. En condiciones de pobreza de nitrógeno, NtcA es co-activada por la proteína PipX. Se conoce que dicha co-activación se debe a la estabilización por parte de PipX de la forma activa del factor NtcA, pero no se sabe si PipX también interacciona con la RNAP y/o juega un papel activándola. El objetivo global del grupo de acogida, experto en determinación de estructuras macromoleculares, es estudiar mediante criomicroscopía electrónica (cryo-EM) la activación de la transcripción por los reguladores globales del metabolismo del nitrógeno NtcA y PipX obteniendo para ello la estructura de estas dos proteínas unidas simultáneamente a la RNAP y al promotor de un gen. Dentro de este plan se enmarca el proyecto de final de máster, cuyo objetivo principal será la obtención de tres variantes de la RNAP de la cianobacteria Synechococcus elongatus de forma recombinante en Escherichia coli utilizando vectores policistrónicos, compatibles para la co-expresión, que portan los genes que codifican las distintas subunidades de la RNAP y su posterior purificación. Además se expresarán y purificarán las proteínas NtcA y PipX.