Dimerización de la fosfatasa dual laforina: identificación y mutagénesis de aminoácidos implicados

Abstract

[EN] Laforin, one of the proteins involved in Lafora Disease (LD, OMIM 254780), presents a modular structure composed by a carbohydrate-binding domain and a dual-specificity phosphatase domain. Although its physiological activity as a carbohydrate phosphatase has been proposed, the interaction with malin - an E3 ubiquitin ligase also involved in the disease - has been described. This interaction results in the formation of a functional complex, implicated in the regulation of many other processes unrelated to laforin’s phosphatase activity, like proteasomal degradation and autophagy. It has been described the capability of laforin to form dimers. Laforin monomers were first postulated to be inactive and the dimerization necessary for the phosphatase activity. However, it has been recently described that laforin activity does not depend on dimerization, and that laforin is present mainly as a monomeric form. The function of laforin dimers and their relation with LD remains unclear, although it has been described that dimerization depends on redox conditions, suggesting that disulphide bonds are involved in the process. Using directed mutagenesis we have designed laforin forms in which cysteine residues have been replaced by serin. One of these mutants (C329S) was unable to form dimers both in bacterial and mammalian cells. Besides, its catalytic activity was not impaired, and the expression levels of the protein were similar to the wild type. Taken together, these results suggest that cysteine 329 is specifically involved in the dimerization process of laforin and hence the C329S mutant constitutes a valuable tool in order to analyze the physiological implications of laforin’s oligomerization.

[ES]Laforina, una de las proteínas implicadas en la Enfermedad de Lafora (LD, OMIM 254780), presenta una estructura modular compuesta por un dominio de unión a carbohidratos y un dominio fosfatasa de especificidad dual. Aunque se ha propuesto su papel fisiológico como fosfatasa de carbohidratos, se ha descrito su interacción con malina, una E3 ubicuitina ligasa implicada también en la enfermedad. Esta interacción da lugar a la formación de un complejo funcional, implicado en muchos otros procesos independientes de la actividad fosfatasa de laforina, como la degradación vía proteasoma o la autofagia. Se ha descrito que laforina es capaz de formar dímeros. En un primer momento se postuló que los monómeros de laforina eran inactivos y la dimerización necesaria para la actividad fosfatasa. Sin embargo, recientemente se ha descrito que la actividad de laforina no depende de la dimerización, y que laforina está presente principalmente en forma monomérica. La función de los dímeros de laforina y su relación con la enfermedad de Lafora permanece oculta, aunque se ha descrito que la dimerización depende de las condiciones redox, sugiriendo que los puentes disulfuro están implicados en el proceso. Utilizando mutagénesis dirigida hemos diseñado formas de laforina en que los residuos de cisteína han sido sustituidos por serina. Uno de estos mutantes (C329S) era incapaz de formar dímeros tanto en bacterias como en células de mamífero. Además, su actividad catalítica permanecía intacta, y sus niveles de expresión eran similares a los del tipo silvestre. En conjunto, estos resultados sugieren que la cisteína 329 está implicada específicamente en la dimerización de laforina y por tanto el mutante C329S constituye una herramienta útil para analizar las implicaciones fisiológicas de la oligomerización de laforina.