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Título

Estudios experimentales sobre la Dicroceliosis

Autor Campo, Raquel
DirectorManga-González, M. Yolanda
Palabras clave Dicrocoelium dendriticum
Dicrocoeliosis
Digenea
Trematoda
Life cycle of D. dendriticum
Experimental ovine Dicrocoeliosis
Species of land molluscs first intermediate hosts of D. dendriticum
Experimental infection of land snails with eggs of D. dendriticum
Species of ants second intermediate hosts of D. dendriticum
Ants in “tetanic stage” naturally infected by D. dendriticum
Diagnosis of D. dendriticum larval stages in molluscs by microscopically techniques
Diagnosis of D. dendriticum metacercariae in ants by microscopically techniques
Morphological e isoenzimatic study of D. dendriticum adults
Experimental infection of lambs with 1000 D. dendriticum metacercariae
Experimental infection of lambs with 3000 D. dendriticum metacercariae
Coprological analyses in the ovine dicrocoeliosis
Hepatic marker enzymes and biochemical parameters in lambs experimentally infected with D. dendriticum
Necropsy of lambs experimentally infected with D. dendriticum
Macroscopic, histopathology, structural and ultra structural study of the liver, gall-bladders, hepatic lymph nodes in lambs experimentally infected with D. dendriticum
Hepatitis portal, fibrosis portal and septal in the experimental dicrocoeliosis
Isoenzimatic study of D. dendriticum adults, metacercariae and sporocysts using isoelectric focusing in thin layer polyacrylamide gel technique
Ciclo Biológico de D. dendriticum
Dicrocoeliosis experimental ovina
Especies de moluscos terrestres primeros hospedadores intermediarios de D. dendriticum
Infecciones experimentales de moluscos terrestres con huevos de D. dendriticum
Especies de hormigas segundos hospedadores intermediarios de D. dendriticum
Hormigas en “tetania” infectadas naturalmente con D. dendriticum
Diagnóstico microscópico de la infección de moluscos por fases larvarias de D. dendriticum
Diagnóstico microscópico de la infección de hormigas por metacercarias D. dendriticum
Estudio morfológico e isoenzimático de adultos de D. dendriticum
Infecciones experimentales de corderos con 1000 y 3000 metacercarias de D. dendriticum, respectivamente
Análisis coprológicos en la dicrocoeliosis experimental ovina
Enzimas marcadoras hepáticas, parámetros bioquímicos en la dicrocoeliosis experimental ovina
Parámetros hemáticos en la dicrocoeliosis experimental ovina
Necropsias de corderos infectados experimentalmente con D. dendriticum
Estudio macroscópico, histopatológico, estructural y ultraestructural del hígado, vías biliares extrahepáticas, vesícula biliar y ganglios linfáticos de corderos infectados por D. dendriticum
Hepatitis portal, fibrosis portal y septal en la dicrocoeliosis experimental ovina
Estudio isoenzimático, mediante isoelectroenfoque en gel de capa fina, de adultos, metacercarias y esporocistos de D. dendriticum
Fecha de publicación 1996
EditorUniversidad de León
Resumen[EN] In order to look into the transmission process of the liver Digenea Dicrocoelium dendriticum (RUDOLPHI, 1819) LOOSS, 1899, in greater depth, studies of parasite behaviour in their intermediate (molluscs and ants) as well as their definitive hosts (lambs) were carried out. Some aspects of the parasite / host relationship were likewise studied. Studies carried out on ants We collected 1,273 specimens of Formica rufibarbis at the tetanic stage between May and October. Of these 814 were dissected to obtain 48,000 D. dendriticum metacercariae used to experimentally infect lambs. The rest of the collected ants were dissected and the metacercariae thus obtained were used as a basis for the morphological and isoenzymatic studies. The number of metacercariae harboured in the abdomen of each ant varied from 1 to 240 (x 59.85 ± 1.51). However, only one larva was found in the subesophagic ganglion. Metacercariae length varied between 336 and 460.8 mm, width between 240 and 368.8 mm and cyst wall between 9.6 and 24 mm. Studies carried out on lambs Two groups of lambs were infected with the metacercariae obtained from the ants, one with a dose of 1,000 and the other with 3,000 metacercariae / lamb. Each of these groups, consisting of 12 four-month-old Churra breed lambs, together with 2 control groups (4 lambs in each) were kept isolated on Agricultural Research Station premises. Half the animals were slaughtered 2 months post-infection (p.i.), and the other half six months p.i. Faeces were collected from the animals' rectums from 1_ months p.i. in order to detect D. dendriticum eggs and then follow their elimination. Fortnightly sampling early in the morning and in the late afternoon continued until the study ended. All the animals tested began D. dendriticum egg elimination between 49 and 79 days p.i., except one which did not eliminate until 2 months p.i. when it died. The eggs were 33.32 mm - 45.22 mm long and 21.42 - 28.56 mm wide. Highest eggs/gram (epg) elimination was observed in the afternoons.
The number of epg eliminated by all the infected lambs varied between 33.33 and 2,266.44 (x 274.81 ± 23.79) and that of lambs infected with 3,000 metacercariae (966.53 ± 147.54 epg) was higher than that of those infected with 1,000 (240.11 ± 45.69). In general the number of epg eliminated by lambs increased as days p.i. and parasite burden did. A relation (r = 0.65) was also observed between the worms recovered from each lamb and the average number of epg eliminated throughout the experiment. That relation was intensified when only epg eliminated between 4 and 6 months p.i. were considered. In addition blood samples were taken from all the lambs at fortnightly intervals from day 0 p.i. to study enzymes and parameters as possible indicators of alterations in liver function. In general values of the hepatic marker enzymes (AST, ALT, LDH, ALP and GGT) and of leucocytes and leucocytic formula obtained from infected lambs differed from those of the control animals. Nevertheless, those of the biochemical parameters (total proteins, albumin, total bilirrubin and glucose) and the rest of the haematic ones (erythrocytes, haematocrit, haemoglobin, MCV, MCH and MCHC) did not alter. Maximum increase, when compared to the controls, was detected in AST (+38%) and ALT (+47%) values of lambs infected with 3,000 metacercariae. Moreover, this increase in the values of both enzymes was significant 60 days p.i. in lambs infected with 1,000 metacercariae, and 30 days p.i. for ALT in those infected with the higher dose. No clear relation was observed between the parasitic burden and, on the one hand, hepatic marker enzyme activity and, on the other, the haematic parameter. Yet the highest values for AST, ALT, GGT, leucocytes and neutrophils and the lowest for lymphocytes were recorded in the animal with the highest number of worms. After carrying out lamb necropsy macroscopic, structural and ultrastructural studies of the organs affected by the parasite were carried out. The macroscopic lesions observed in the liver, extrahepatic bile ducts, gall bladder and hepatic lymph ganglions were qualitatively similar in the different infected animal groups, though more intense in those slaughtered 6 months p.i. and those infected with the higher dose. On the other hand, the location of D. dendriticum in the septal bile and hepatic ducts caused hyperplasia and an increase in secretory activity as well as marked atrophy and necrosis of the duct epithelium due to mechanical irritation of the parasite itself and the erosive effect of its sucker. Moreover, experimental ovine dicroceliosis follows a course of portal hepatitis and portal, septal and, occasionally, perisinusoidal fibrosis, above all in those animals which were host to more worms, but alterations compatible with hepatic cirrhosis were not observed. The greatest weight loss, when compared to the controls, was observed in the 2 groups of infected lambs 60 days p.i. and the highest loss was recorded in animals with 401 to 600 worms. The number of worms recovered from the liver and gall bladder of each lamb varied between 119 and 2,063 in those infected with 3,000 metacercariae and between 30 and 437 in those infected with 1,000. The size and degree of development of the worms 2 months p.i. was generally inferior to that of those recovered 6 months p.i.
Studies carried out on molluscs After not eating for 4 days 948 specimens of Cernuella (Xeromagna) cespitum arigonis (SCHMIDT, 1853), divided into 5 groups, were infected with individual doses of 50 to 150 D. dendriticum eggs obtained from an experimentally infected lamb. After infection these molluscs and the control animals were kept in environmental simulation chambers at a temperature of 20º C and relative humidity of 50%. According to the results of individual analyses of mollusc faeces collected daily, elimination of D. dendriticum eggs ceased 48 hours after infection finished. In order to follow the larval development of the parasite at least 6 molluscs were killed at 20 - day intervals from day 1 p.i. Infection was not visible by stereomicroscope, at least until 50 days p.i. when daughter sporocysts with non-evolved germinal mass, which filled very small parts of the hepatopancreas, were observed. From that date sporocysts began to emigrate and invade other parts of the hepatopancreas and only after 110 days p.i. were sporocysts with more or less evolved cercariae found. Slime balls containing cercariae of D. dendriticum emitted by the molluscs were not observed despite examining infected molluscs until 189 days p.i. D. dendriticum isoenzymatic studies In order to characterize the different stages of D. dendriticum, study their possible genetic variability and establish the corresponding isoenzymatic models, the isoelectric focusing in thin layer polyacrylamide gel technique was used to analyze 2,846 worms, 1,608 metacercariae and a variable number of sporocysts from 25 infected molluscs. According to our results LDH, GPI and PGM were the most appropriate enzymatic systems to characterize D. dendriticum. Some of the isoenzymatic models were common in D. dendriticum adults, metacercariae and sporocysts or in 2 of these development stages. A certain relation seerns to exist between some enzymatic models detected in D. dendriticum adults, the animal breed from which the parasites come and their place of origin. On the other hand, the best enzymatic systems for the detection of D. dendriticum in molluscs were: LDH, since it presents no activity in mollusc tissue althought the parasite was not detected until 45 days p.i.; GPI, because the parasite is already observed 15 days p.i. (despite overlapping of some bands with those of the snail hepatopancreas); and PGM, as parasite bands are situated in a pH range different from those of the molluscs and allowed parasite detection 30 days p.i.
[ES] Con el fin de profundizar en el conocimiento sobre el proceso de transmisión del Digenea hepático Dicrocoelium dendriticum (RUDOLPHI, 1819) LOOSS, 1899, se han abordado estudios sobre el comportamiento del parásito tanto en sus hospedadores intermediarios (moluscos y hormigas) como definitivos (corderos). Asimismo, se han investigado diversos aspectos de la relación parásito/hospedador. Estudios realizados en hormigas Se recolectaron 1.273 ejemplares de Formica rufibarbis en fase de tetania, en los meses de Mayo a Octubre, 814 de los cuales se diseccionaron para la obtención de las 48.000 metacercarias de D. dendriticum utilizadas en la infección experimental de los corderos. Del resto de las hormigas recolectadas se consiguieron las metacercarias que sirvieron de base en los estudios morfológicos e isoenzimáticos. El número de metacercarias albergadas en el abdomen de cada hormiga varió entre 1 y 240 (x 59,85 ± 1,51), sin embargo, en el ganglio subesofágico sólo encontramos una larva. La longitud de las metacercarias enquistadas osciló entre 336 y 460,8 mm, la anchura entre 240 y 368,8 mm y el grosor de la pared del quiste entre 9,6 y 24 mm. Estudios realizados en corderos Con las metacercarias obtenidas de las hormigas se infectaron 2 lotes de corderos, uno con una dosis de 1.000 metacercarias/cordero y otro con 3.000 metacercarias/cordero. Cada uno de estos lotes, constituido por 12 animales de raza Churra y 4 meses de edad, junto con otros 2 lotes testigos (de 4 animales cada uno) se mantuvieron aislados en las dependencias de la Estación Agrícola Experimental. La mitad de dichos animales se sacrificaron a los 2 meses post-infección (p.i.) y la otra mitad a los 6. Para la detección y posterior seguimiento de la eliminación de huevos de D. dendriticum en las heces de los corderos, se inició la recogida de las mismas del recto de los animales al mes y medio p.i., continuando con muestreos quincenales a primeras horas de la mañana y a últimas de la tarde, hasta el final de la experiencia. Todos los corderos probados comenzaron la eliminación de huevos de D. dendriticum entre los 49 y 79 días p.i., excepto cuatro de ellos, que no eliminaron antes de los 2 meses, fecha en que se sacrificaron 3 de los mismos, mientras que el otro murió. Dichos huevos medían entre 33,32 y 45,22 mm de longitud y entre 21,42 y 28,56 mm de anchura. La eliminación de huevos por gramo (hpg) más elevada se observó por la tarde.
El número de hpg eliminado por la totalidad de los corderos infectados osciló entre 33,33 y 2.266,44 (x 274,81 ± 23,79) y el de los infectados con 3.000 metacercarias (966,53 ± 147,54) fue superior al de los infectados con 1.000 (240,11 ± 45,69). En general, se produjo un incremento en el número de hpg eliminado por los corderos al aumentar los días p.i. y la carga parasitaria. Asimismo se observó relación (r= 0,65) entre los vermes recuperados de cada uno de los corderos y el número medio de hpg eliminado a lo largo de todo el experimento. Dicha relación se intensificó cuando consideramos sólo los hpg eliminados entre los 4 y 6 meses p.i. Además, en todos los corderos se efectuaron sangrías quincenales, desde el día 0 p.i., para el estudio de enzimas y parámetros, posibles indicadores de alteraciones en la funcionalidad del higado. En general, los valores de las enzimas marcadoras hepáticas (AST, ALT, LDH, FA y GGT) y los de leucocitos y fórmula leucocitaria obtenidos en los corderos infectados difirieron de los de los testigos. Sin embargo, los de los parámetros bioquímicos (proteinas totales, albúmina, bilirrubina total y glucosa) y del resto de los hemáticos (eritrocitos, hematócrito, hemoglobina, VCM, HCM y CHCM) no se alteraron. El mayor incremento se detectó en los valores de AST (+ 38%) y de ALT (+47%) de los corderos probados con 3.000 metacercarias, con respecto a los testigos. Además, dicho aumento en los valores de ambas enzimas fue significativo a los 60 días p.i., en los corderos infectados con 1.000 metacercarias, y a los 30 días p.i., para ALT, en los probados con la dosis más alta. No se observó una relación clara entre la carga parasitaria y, por una parte, la actividad de las enzimas marcadoras hepáticas y, por otra, los parámetros hemáticos, aunque en el animal con mayor número de vermes se detectaron los valores más altos de AST, ALT, GGT, leucocitos y neutrófilos, y los más bajos de linfocitos. Después de efectuar la necropsia de los corderos, se realizaron estudios macroscópicos, estructurales y ultraestructurales de los órganos afectados por el parásito. Las lesiones macroscópicas observadas en el hígado, vías biliares extrahepáticas, vesícula biliar y ganglios linfáticos hepáticos fueron cualitativamente similares en los diferentes grupos de animales infectados, aunque más intensas en los sacrificados a los 6 meses p.i. y en los probados con la dosis más alta. Por otra parte, la localización de D. dendriticum en los conductos biliares septales y conducto hepático provocó hiperplasia, incremento de la actividad secretora, así como atrofia y necrosis marcadas del epitelio ductal, debidas a la irritación mecánica del propio parásito y al efecto erosivo de su ventosa. Además, la dicroceliosis experimental ovina cursa con hepatitis portal y con fibrosis portal septal y, en ocasiones, perisinusoidal, sobre todo en aquellos animales que albergaban más vermes, pero no se observan, sin embargo, alteraciones compatibles con una cirrosis hepática.
El mayor descenso de peso, con respecto a los testigos, se observó, a los 60 días p.i., en los dos grupos de corderos infectados, y la pérdida más elevada se detectó en los animales con 401 a 600 vermes. El número de parásitos recuperado de hígado y vesícula biliar de cada cordero osciló entre 110 y 2.063 en los probados con 3.000 metacercarias, y entre 30 y 437 en los infectados con 1.000. El tamaño y el grado de maduración de los vermes a los 2 meses p.i. fue, en general, inferior al de los obtenidos a los 6 meses. Estudios realizados en moluscos Previo ayuno de 4 dias, se probaron 948 ejemplares de Cernuella (Xeromagna) cespitum arigonis (SCHMIDT, 1853), distribuidos en 5 lotes, con dosis individualizadas de 50 a 150 huevos de D. dendriticum , procedentes de un cordero infectado experimentalmente por nosotros. Después de la infección, dichos moluscos junto con los testigos se mantuvieron en una cámara de simulación ambiental a 20º C de temperatura y 50% de humedad relativa. De acuerdo con los resultados de los análisis individualizados de las heces de los moluscos, recolectadas diariamente, la eliminación de huevos de D. dendriticum cesa a las 48 horas después de finalizada la infección. Para seguir el desarrollo larvario del parásito, se sacrificaron al menos 6 moluscos, cada 20 dias, desde el primer día p.i. La infección no fue visible, al estereomicroscopio, al menos hasta el día 50 p.i., fecha en la que se observaron esporocistos hijos con masas germinales indiferenciadas, que ocupaban porciones muy reducidas del hepatopáncreas. A partir de dicha fecha los esporocistos comenzaron a emigrar e invadir otras partes del hepatopáncreas, y sólo después de los 110 días p.i. encontramos esporocistos con cercarias más o menos desarrolladas, aunque no vimos bolas de mucus emitidas por los caracoles conteniendo cercarias, a pesar de haber examinado moluscos parasitados hasta el día 189 p.i. Estudios isoenzimáticos de D. dendriticum Con el fin de caracterizar las diferentes fases de D. dendriticum, estudiar la posible variabilidad genética de las mismas y establecer los correspondientes modelos isoenzimáticos, analizamos, mediante la técnica de isoelectroenfoque en gel de capa fina de poliacrilamida, 2.846 adultos, 1.608 metacercarias y un número variable de esporocistos, procedentes de 25 moluscos infectados. De acuerdo con nuestros resultados, los sistemas enzimáticos más adecuados para la caracterización de D. dendriticum fueron LDH, GPI y PGM. Algunos de los modelos enzimáticos fueron comunes en los adultos, las metacercarias y los esporocistos de D. dendriticum o en 2 de dichas fases de desarrollo. Parece que existe cierta relación entre algunos tipos enzimáticos detectados en los adultos de D. dendriticum , la raza de los animales de los que dichos parásitos proceden y el lugar de origen de los mismos. Por otra parte, los mejores sistemas enzimáticos para la detección de D. dendriticum en los moluscos fueron: LDH, ya que no presenta actividad en el tejido de los moluscos, aunque no detectó el parásito hasta los 45 días p.i.; GPI, por evidenciar el parásito ya a los 15 días p.i. (a pesar de que existe solapamiento de algunas bandas con las del hepatopáncreas del caracol); y PGM, pues las bandas del parásito se sitúan en un rango de pH distinto de las del molusco y permitió detectar el parásito a los 30 días p.i.
Descripción Tesis Doctoral de la Universidad de León, Departamento de Patología Animal (Sanidad Animal) y la Estación Agrícola Experimental (EAE-CSIC), defendida en la Facultad de Veterinaria de la Universidad de León el 14 de Marzo de 1996.
URI http://hdl.handle.net/10261/92666
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