Estructura y función de las hemoglobinas de leguminosas

Abstract

Las leguminosas son el segundo grupo de plantas más importantes después de los cereales, ya que constituyen una fuente de proteína para la alimentación humana y animal (Sánchez y cols, 2008). Las leguminosas de interés agronómico y diversas leguminosas arbóreas y arbustivas juegan un papel fundamental al ser capaces de fijar (reducir) el N2 atmosférico a amonio, tras establecer simbiosis con los rizobios del suelo. Como resultado de la interacción rizobio-leguminosa se forma un órgano nuevo, el nódulo, en el que tiene lugar el proceso de fijación de N2 por el complejo enzimático nitrogenasa, que se expresa en los bacteroides. El O2 puede inactivar irreversiblemente la nitrogenasa pero por otro lado es necesario para cubrir la demanda energética de las células del nódulo durante el proceso de fijación. Debido a esto, el nivel de O2 debe estar estrictamente controlado en el nódulo. Un mecanismo mediante el cual se controla el nivel de O2 involucra a la leghemoglobina (Lb), una hemoproteína transportadora de O2. La Lb fue la primera hemoglobina (Hb) que se descubrió en plantas (Kubo, 1939). Actualmente, además de las Hbs simbióticas, se han descrito otro tipo de Hbs: las Hbs no simbióticas (que se dividen en Hbs de clase 1 y clase 2) y las Hbs truncadas o de clase 3 (Watts y cols, 2001; Dordas, 2009; Smagghe y cols, 2009;). Si bien existe mucha información sobre la estructura y función de las Hbs de clase 1 (Hunt y cols, 2002; Igamberdiev y Hill, 2004), nuestro conocimiento sobre las Hbs de clase 2 (Trevaskis y cols, 1997; Hebelstrup y cols, 2006) y clase 3 (Watts y cols, 2001; Vieweg y cols, 2005) es muy limitado. Además, la mayor parte de los estudios in vivo o in vitro se han llevado a cabo con Arabidopsis thaliana, planta modelo que codifica tres Hbs (Trevaskis y cols, 1997; Watts y cols, 2001). Sin embargo, el genoma de la leguminosa modelo Lotus japonicus contiene cinco genes de Hbs no simbióticas y truncadas (Bustos-Sanmamed y cols, 2011), y lo mismo parece ocurrir en otras leguminosas como soja o Medicago truncatula (Vieweg y cols, 2005). El objetivo de esta Tesis fue estudiar distintos aspectos de la estructura y función de las Hbs no simbióticas y truncadas de L. japonicus.

En esta Tesis se han estudiado principalmente las Hbs no simbióticas y truncadas de L. japonicus, si bien algunos experimentos se realizaron con las Lbs de judía y soja. Los objetivos planteados fueron: 1. Producción de Hbs recombinantes de L. japonicus. Se incluye en este objetivo la optimización de las condiciones para la obtención en Escherichia coli de todas las Hbs no simbióticas de clase 1 (Glb1-1 y GLb1-2) y de clase 2 (Glb2), así como las Hbs ‘truncadas’ o de clase 3 (Glb3-1 y Glb3-2). 2. Caracterización bioquímica de las cinco Hbs. Se incluye en este objetivo el estudio de la reducción in vitro de las formas férricas (inactivas) a ferrosas (activas) de las Hbs, y la localización subcelular del posible mecanismo que mantiene las Hbs en estado funcional. 3. Obtención de anticuerpos policlonales frente las tres clases de Hbs e inmunolocalización celular y subcelular de las Hbs en nódulos, raíces y hojas de L. japonicus. 4. Estudio de la nitración de residuos de tirosinas como modificación postraduccional de las Lbs in vivo. 5. Complementación de una cepa mutante de levadura deficiente en flavohemoglobina con las Hbs de L. japonicus cuando se exponen las células de levadura a estrés oxidativo y nitrosativo.