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Title

Análisis de la vía de transducción de señal mediada por c-di-GMP en Salmonella: mecanismos de especificidad y regulación de la movilidad

AuthorsZorraquino, Violeta
AdvisorLasa, Íñigo ; Solano Goñi, Cristina
Issue Date2012
PublisherUniversidad Pública de Navarra
CSIC-GN-UPNA - Instituto de Agrobiotecnología (IDAB)
AbstractSalmonella es capaz de adherirse a superficies y formar comunidades de bacterias embebidas en una matriz que ellas mismas han producido denominadas biofilms, que les confiere una mayor resistencia a la desecación y una mayor tolerancia a agentes antimicrobianos. Salmonella entérica serovar Enteritidis, un patógeno alimenticio de gran relevancia tanto clínica como agronómica, es capaz de formar biofilms sobre diversos materiales y en diferentes condiciones ambientales. La formación de biofilms en explotaciones agropecuarias y lugares donde se procesan alimentos es una fuente potencial de contaminación y transmisión de este patógeno. Por ello, es muy importante el desarrollo de nuevas estrategias que impidan la formación de biofilm o lo desestabilicen por medio de la identificación de genes esenciales para el proceso de formación de biofilm y su mantenimiento. Durante las últimas dos décadas se ha investigado una nueva vía de señalización bacteriana basada en los niveles intracelulares de un dinucleótico cíclico, c-di-GMP, que controla varios procesos en la biología bacteriana, como la formación de biofilm. Con el objetivo de conocer la implicación del c-di-GMP en la biología de Salmonella el laboratorio de biofilms microbianos trabaja en una línea de investigación dedicada al análisis de las proteínas involucradas en su metabolismo así como de sus efectores celulares, dentro de la cual se engloba el trabajo descrito en esta tesis doctoral. La primera parte de la tesis se ha dedicado al estudio del mecanismo de especifidad de las 12 proteínas GGDEF presentes en Salmonella, responsables de la síntesis c-di-GMP en diferentes condiciones desvelando una presencia aparentemente constitutiva de la mayoría de ellas. Como esta expresión constitutiva dificulta el análisis de sus funciones individuales, se ha independizada cada proteína GGDEF del resto de la familia por medio de la restauración individual de cada proteína GGDEF sobre un mutante múltiple que carece de los 12 genes que codifican proteínas GGDEF. Nuestros resultados muestran una expresión similar de las proteínas GGDEF en ausencia del resto de la familia. Además se ha observado que varias proteínas GGDEF son capaces de activar la producción de celulosa sugiriendo que no existe una especifidad funcional y que diferentes proteínas GGDEF pueden contribuir a un pool globar de c-di-GMP. En el capítulo 2 se han seleccionado dos proteínas GGDEF caracterizadas previamente en el laboratorio, SEN1023 y AdrA. Estas dos proteínas son capaces de activar la síntesis de celulosa en diferentes condiciones y poseen distintos patrones de expresión. Con el objeto de analizar si la especifidad de estas proteínas para activar la producción de celulosa en cada una de estas condiciones se debe a su diferente patrón de expresión, se ha realizado un intercambio de los elementos reguladores de la expresión de ambos genes. Los resultados obtenidos muestran que los intercambios realizados no dan lugar a un nivel de expresión equiparable y sugieren la existencia de mecanismos de regulación post-transcripcional en estos genes.
Por último, en el capítulo 3 se ha analizado un fenotipo asociado a la presencia de altos niveles de c-di-GMP en Salmonella, la inhibición de la movilidad. Hasta el momento se había descrito que la proteína PilZ YcgR al unir c-di-GMP, actúa como un embrague molecular en el complejo ¿switch¿ del flagelo, frenando a la bacteria. En este trabajo hemos construido y analizado varias cepas de Salmonella que presentan altos niveles de c-di-GMP y que son inmóviles aún en ausencia de YcgR con el objetivo de identificar la diana que une c-di-GMP para controlar la movilidad de Salmonella de una forma YcgR independiente. El análisis de mutantes capaces de recuperar la movilidad en presencia de altos niveles de c-di-GMP y ausencia de YcgR ha revelado que mutantes en el operón de la síntesis de celulosa recuperan la movilidad inhibida por el c-di-GMP. Una caracterización de este proceso ha demostrado que la presencia de celulosa en la superficie de la bacteria provoca una inhibición completa de la rotación flagelar. Estos resultados refuerzan estudios previos que indican que el c-di-GMP modula la transición de un modo de vida planctónico a un modo de vida sésil. Dada la importancia de controlar esta transición de manera eficaz, cuando la bacteria inicia la formación de biofilm, el c-di-GMP garantiza que la movilidad se bloquee completamente actuando a dos niveles independientes. Por un lado, a través de la proteína YcgR que interactúa directamente con la maquinaria flagelar y por otro, mediante la síntesis del exopolisacárido celulosa que, probablemente a través de un impedimento estérico, asegura que el bloqueo de la movilidad sea completo.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/72487
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