Bases moleculares de la síntesis de termoespermina y sus implicaciones en el desarrollo vascular de Arabidopsis thaliana

Abstract

Las poliaminas son pequeñas moléculas orgánicas policatiónicas presentes en todos los seres vivos. En las plantas regulan diversos procesos de desarrollo, como la floración, el crecimiento del tallo, la fructificación y la senescencia. La termoespermina es una tetraamina exclusiva de las plantas y procariotas cuya deficiencia, por la mutación del único gen responsable de su síntesis, ACL5, provoca un fenotipo enano en Arabidopsis thaliana, acompañado de graves defectos en la diferenciación de las células del metaxilema y una severa alteración en el patrón de formación de pared secundaria de los vasos. Las aminopropil transferasas catalizan la síntesis de tri- y tetraaminas mediante la incorporación de un grupo aminopropilo a una di- o triamina, respectivamente. Estas aminopropil transferasas presentan un alto grado de similitud de secuencia entre sí, compartido además con las putrescina-Nmetiltransferasas, otro grupo de enzimas presentes exclusivamente en las solanáceas. Estudios filogenéticos han mostrado que las aminopropil transferasas y las putrescina-N-metil transferasas están emparentadas evolutivamente. Los objetivos que nos planteamos en esta tesis fueron: • establecer el mecanismo por el que la termoespermina controla la correcta formación del xilema; y • determinar las diferencias estructurales entre las diversas aminopropil transferasas y putrescina-N-metiltransferasas, responsables de su especificidad.

El primer objetivo lo abordamos mediante la búsqueda de supresores extragénicos de acl5. De los 40 supresores dominantes aislados, 11 de ellos presentan mutaciones en la región 5´-UTR de tres genes bHLH, a los que denominamos AJAX. Las mutaciones se localizan en una secuencia que codifica un pequeño péptido cuyo papel es reprimir la traducción de la ORF principal. Nuestros estudios in vitro indican que la supresión se consigue interfiriendo con la síntesis o la actividad de dicho pequeño péptido y permitiendo la síntesis de las proteínas AJAX. El papel de estos factores de transcripción en la regulación de la expresión génica durante el desarrollo del xilema solapa en parte con el de la termoespermina, pero no completamente, según indican los análisis transcriptómicos efectuados en plantas superproductoras de AJAX2. El segundo objetivo se abordó mediante la comparación de los centros activos de las aminopropil transferasas y las putrescina-N-metil transferasas, y la identificación de aminoácidos potencialmente clave para sus actividades diferenciales. Se produjeron las correspondientes aminopropil transferasas recombinantes de Arabidopsis en sus versiones nativa y con los residuos clave mutados como en una putrescina-N-metil transferasa, y se compararon los parámetros cinéticos de ambas versiones. En ninguno de los casos fue posible convertir una actividad específica en otra, pero se confirmó la importancia de dichos residuos para la actividad enzimática.