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Título : Análisis funcional y localización subcelular de las proteínas implicadas en el movimiento intra e intercelular del virus de las manchas necróticas del melón (MNSV)
Autor : Genovés, Ainhoa
Director: Pallás Benet, Vicente; Navarro Bohigues, José Antonio
Palabras clave : Carmovirus
Movimiento intracelular
Aparato de Golgi
Carmoviruses
Intracellular movement
Golgi apparatus
Fecha de publicación : 2008
Editor: Universidad Politécnica de Valencia
CSIC-UPV - Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas Primo Yúfera (IBMCP)
Resumen: [ES] Los virus de plantas constituyen, en ocasiones, una seria amenaza para numerosos cultivos. A pesar de las numerosas investigaciones realizadas, existe un gran desconocimiento de las rutas y los mecanismos que operan en la invasión viral de los correspondientes huéspedes. El bloqueo en el movimiento viral constituye uno de los mecanismos de resistencia natural más frecuentes a los virus. El progreso en el conocimiento de estas etapas del ciclo viral puede llevar a estrategias antivirales. En el presente trabajo se ha pretendido caracterizar estructural y funcionalmente las 5 proteínas codificadas por el genoma del MNSV, haciendo especial hincapié en caracterizar los factores, tanto virales como celulares, que intervienen en el transporte intra e intercelular del virus.
Como paso previo y necesario, en el Capítulo 1 de la presente Tesis, se ha obtenido un clon infeccioso del MNSV, denominado pMNSV(Al), a partir del cual se pueden generar transcritos in vitro capaces de reproducir la misma sintomatología que el virus tras la inoculación mecánica sobre el huésped natural (melón). Este clon infeccioso constituye una herramienta molecular indispensable que ha permitido realizar un análisis funcional de los genes virales. Así, mediante técnicas de mutagénesis dirigida sobre el clon pMNSV(Al), se ha obtenido una colección de mutantes que impiden la expresión de cada una de las ORFs del genoma del virus. Además, las mismas modificaciones se han efectuado sobre un clon quimérico, pMNSV(Al)-Δcp-GFP, en el que se ha sustituido la ORF que codifica la CP viral por el gen testigo de la proteína de fluorescencia verde (GFP). Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las proteínas 29 y 89 estarían implicadas en la replicación del genoma. Por otro lado, la p7A y la p7B participarían en el movimiento célula a célula del virus. Por último, p42 ó CP, además de su papel estructural, es necesaria para la invasión sistémica del virus, siendo capaz de acentuar la sintomatología. Asimismo, ensayos de expresión transitoria de cada una de las ORFs del virus han puesto de manifiesto la capacidad de las proteínas 7B y CP para suprimir el silenciamiento génico de RNA, favoreciendo esta última el movimiento local del virus.
[EN] Plant viruses constitute a serious threat for numerous crops. In spite of the numerous researches carried out, there is still a great ignorance of the routes and the mechanisms that operate in the viral invasion of the corresponding host. It is important to emphasize that the blockade in the viral movement constitutes one of the more frequent mechanisms of natural resistance to virus. So, the progress in the knowledge of these stages of the viral cycle can lead to antiviral strategies. In the present work, the structure and the function of the 5 proteins codified by the MNSV genome have been characterized, doing special support in characterizing the factors, both viral and cellular, that intervene in the intra- and intercellular transport of the virus.
As previous and necessary step, in Chapter 1 of the present Thesis, an infectious clone of the MNSV has been obtained, pMNSV, from which in vitro transcripts can be generated capable of reproducing the same symptoms of the virus after its mechanical inoculation in the natural host (melon). This infectious clone constitutes an indispensable molecular tool that has allowed to carry out a functional analysis of the viral genes. This way, by pMNSV clone oligonucleotide-directed mutagenesis, mutants have been obtained that prevent the expression of each one of the virus genome ORFs. In addition, the same modifications have been applied on the recombinant clone, pMNSV-Δcp-GFP, where the p42 ORF from the full-length clone has been replaced by the green fluorescence protein (GFP) reporter gene. The results revealed that the proteins 29 and 89 would be involved in the genome replication. On the other hand, the p7A and the p7B would take part in the virus cell-to-cell movement. Finally, the p42 ó CP, besides its structural role, is necessary for the virus systemic invasion, being capable of accentuating the symptoms. Likewise, the proteins 7B and CP, among all the MNSV encoded proteins, were able to delay the RNA silencing in transient expression assays. Finally, the p42 favoured the virus local movement.
[CAT] Els virus de plantes constitueixen, de vegades, una seria amenaça per a molts cultius. A pesar de les nombroses investigacions realitzades, existeix encara un gran desconeixement de les rutes i els mecanismes que operen en la invasió viral dels corresponents hostes. És important destacar que el bloqueig en el moviment viral constituïx un dels mecanismes de resistència natural més freqüents als virus. El progrés en el coneixement d'aquestes etapes del cicle viral pot dur a estratègies antivirals. En el present treball s'ha pretès caracteritzar estructural i funcionalment les 5 proteïnes codificades pel genoma del MNSV, fent especial èmfasi a caracteritzar els factors, tant virals com cel•lulars, que intervenen en el transport intra i intercelular del virus.
Com pas previ i necessari, en el Capítol 1 de la present Tesi, s'ha obtingut un clon infecciós del MNSV, denominat pMNSV(Al), a partir del qual es poden generar transcrits in vitro capaços de reproduir la mateixa sintomatologia que el virus després de la inoculació mecànica sobre l'hoste natural (meló). Aquest clon infecciós constituïx una eina molecular indispensable que ha permès realitzar una anàlisi funcional dels gens virals. Així, mitjançant tècniques de mutagénesi dirigida sobre el clon pMNSV(Al), s'ha obtingut una col•lecció de mutants que impedeixen l'expressió de cadascuna de les ORFs del genoma del virus. A més, les mateixes modificacions s'han efectuat sobre un clon quimèric, pMNSV(Al)-Δcp-GFP, en el qual s'ha substituït la ORF que codifica la CP viral pel gen testimoni de la proteïna de fluorescència verda (GFP). Els resultats obtinguts posen de manifest que les proteïnes 29 i 89 estarien implicades en la replicació del genoma. D'altra banda, la p7A i la p7B participarien en el moviment cèl•lula a cèl•lula del virus. Finalment, p42 o CP, a més del seu paper estructural, és necessària per a la invasió sistèmica del virus, sent capaç d'accentuar la sintomatologia. Així mateix, assajos d'expressió transitòria de cadascuna de les ORFs del virus han posat de manifest la capacitat de les proteïnes 7B i CP per a suprimir el silenciament gènic de RNA, afavorint aquesta última el moviment local del virus.
Descripción : Tesis doctoral realizada en el Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas de Valencia (IBMCP-CSIC-UPV).
URI : http://hdl.handle.net/10261/4558
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