Identificación de proteínas fosforiladas en células B mediante Pro-Q Diamond y espectrometría de masas

Abstract

La fosforilación de las proteínas en residuos de serina, treonina o tirosina es una modificación post-transduccional dinámica y reversible, y representa un mecanismo clave para la regulación de la estructura y de la función de las mismas, y juega un papel clave en la regulación de las vías de señalización. Se estima que hasta el 50% de todas las proteínas pueden ser modificables por la acción de proteínas quinasas y fosfatasas. El estudio del fosfoproteoma se ha podido llevar a cabo debido al desarrollo de nuevas técnicas, como la espectrometría de masas y la bioinformática. Sin embargo, hoy en día sigue habiendo limitaciones metodológicas para el estudio del fosfoproteoma y la identificación de proteínas fosforiladas y de los sitios de fosforilación sigue siendo un reto en proteómica. Estudios de las fosfoproteínas han contado con la utilización de anticuerpos específicos frente a aminoácidos fosforilados; como serina, treonina y tirosina. Pero una limitación es la disponibilidad y la especificidad de los mismos. También se han utilizado los métodos de selección de proteínas fosforiladas. La limitación de estos métodos es que hay un porcentaje de pérdida de proteínas fosforiladas durante el procedimiento de selección [1]. En esta tesis de master el objetivo es identificar proteínas fosforiladas en líneas celulares de linfocitos B humanos estimulados con PMA más Ionomicina. Se ha realizado el estudio utilizando dos abordajes: un abordaje ha consistido en la utilización de un teñidor fluorescente llamado Pro-Q Diamond que tiñe de forma selectiva fosfoproteínas en geles de poliacrilamida. Esta tinción fluorescente permite la detección de grupos fosfatos en serina, treonina y tirosina. Para la identificación posterior de las proteínas fosforiladas candidatas, se ha utilizado otra segunda tinción fluorescente que se une en este caso a todas las proteínas llamada SYPRO ruby. En el gel, el análisis comparativo de las imágenes obtenidas por Pro-Q Diamond con respecto a SYPRO ruby, nos permite la localización de proteínas fosforiladas en el gel. Esta fase se complementó con la extracción de las proteínas seleccionadas del gel, para su digestión con tripsina y su identificación mediante huella peptídica por espectrometría de masas (MALDI-TOFF). El segundo abordaje ha consistido en la utilización de anticuerpos específicos que reconocen residuos fosforilados en serina, treonina o tirosina. Estas dos aproximaciones experimentales nos ha permitido la identificación de diversas proteínas fosforiladas con implicaciones funcionales.