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Title

Estudios moleculares del sistema regulador de la degradación anaeróbica de benzoato en Azoarcus sp. CIB

AuthorsDurante-Rodríguez, Gonzalo
AdvisorDíaz Fernández, Eduardo; Carmona, Manuel
KeywordsAzoarcus
benzoato
regulación
Issue Date2009
PublisherCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
Universidad Complutense de Madrid
AbstractA continuación se exponen las conclusiones extraídas a lo largo de este trabajo: 1. Se ha caracterizado la regulación sobreimpuesta mediada por oxígeno del cluster bzd implicado en la degradación anaeróbica de benzoato en Azoarcus sp. CIB. La actividad del promotor catabólico PN es estrictamente dependiente de la ausencia de oxígeno y requiere una proteína activadora, e. g., Fnr de E. coli, que se une a una región operadora centrada en la posición -42.5, indicando que se trata de un promotor de clase II. 2. La proteína Fnr está implicada tanto en el reclutamiento de la RNAP en el promotor PN como en la formación del complejo abierto en el inicio de la transcripción. 3. Se ha identificado un nuevo gen regulador, denominado acpR, en Azoarcus sp. CIB que codifica un homólogo de la proteína Fnr de E. coli, cuyo papel es crucial en la degradación anaeróbica de compuestos aromáticos ya que es imprescindible para la activación del promotor PN en ausencia de oxígeno. 4. Se ha caracterizado la regulación del gen bzdR, cuya expresión a partir del promotor PR está reprimida por la proteína BzdR y se activa débilmente en presencia del inductor benzoil-CoA. 5. La región operadora de la proteína BzdR en el promotor PR solapa con las cajas -10 y -35 de interacción con la RNAP, así como con el sitio de inicio de la transcripción (+1), lo que está de acuerdo con la función represora observada para esta proteína.
6. Mientras que el promotor catabólico PN se encuentra sometido a represión catabólica mediada por ácidos orgánicos no aromáticos, tales como succinato, piruvato o acetato, el promotor PR no. Además, el promotor PR tampoco está sometido al control dependiente de los niveles de oxígeno y mediado por la proteína AcpR.7. La proteína BzdR, un homodímero con simetría bilateral, posee una arquitectura modular constituida por dos dominios, N-terminal (NBzdR) o efector y C-terminal (CBzdR) o regulador, conectados por una región linker (LBzdR). Ambos dominios son estructural y funcionalmente independientes. El dominio N-terminal purificado, tanto con linker (NBzdRL) como sin linker (NBzdR), es un dímero que interacciona específicamente con el DNA diana, convirtiéndose en un “super-represor” del promotor PN in vivo. El dominio CBzdR purificado es un monómero que interacciona específicamente con la molécula efectora, benzoil-CoA, lo que se traduce en un cambio conformacional. 8. La región LBzdR está implicada en la transmisión de información desde el dominio CBzdR, que sufre un cambio conformacional al unir el benzoil-CoA, al dominio NBzdR, que detecta dicho cambio conformacional y modifica su interacción con el promotor PN permitiendo su activación. Determinadas mutaciones en la región LBzdR impiden la conformación dimérica de BzdR y su interacción efectiva con el promotor PN. 9. Se ha podido establecer un modelo de acción para la proteína BzdR basado en la similitud estructural del dominio CBzdR con la enzima siquimato quinasa, y del dominio NBzdR con la región de unión al DNA de reguladores de la familia HTHXRE.
10. La naturaleza modular de la proteína BzdR ha permitido la construcción de quimeras artificiales con nuevas funciones reguladoras y que confirman la función asignada a cada uno de los dominios de BzdR. El dominio LCBzdR fusionado al dominio N-terminal del represor CI del fago λ dio lugar a una quimera (Qλ) capaz de controlar el ciclo lítico del fago, utilizando benzoil-CoA como molécula efectora. Por su parte, el dominio NBzdRL fusionado a la enzima SKI de E. coli dio lugar a una quimera (Q1) bifuncional, con actividad enzimática siquimato quinasa y capaz de controlar la actividad del promotor PN in vitro utilizando siquimato como inductor. La eliminación selectiva de la actividad siquimato quinasa de la quimera Q1 mediante una mutación dirigida que impedía la unión del cofactor, Mg2+, generó una nueva quimera (Q2) que actuaba en la célula como un regulador análogo a BzdR pero que responde a siquimato, en lugar de a benzoil-CoA, para la activación del promotor PN. 11. Los resultados obtenidos con las quimeras funcionales Q1 y Q2 han permitido la elaboración de un modelo sobre el origen evolutivo de la proteína BzdR basado en la fusión de un dominio siquimato quinasa con un dominio HTH de unión a DNA, y su posterior evolución al reconocimiento del benzoil-CoA como efector. 12. La proteína BzdR posee una mayor afinidad por la región operadora I del promotor PN que por las regiones operadoras II y III. Aunque la región operadora I es suficiente para generar un promotor PNI activo y sometido al control de BzdR, la presencia de las regiones operadoras II y III en el promotor PN incrementa ligeramente los niveles de represión dependientes de BzdR. 13. La unión de la proteína BzdR a las tres regiones operadoras del promotor PN es cooperativa. La estequiometría de la interacción es de 4 dímeros (8 moléculas) de BzdR por molécula de promotor PN, uniéndose 2 dímeros a la región operadora I. 14. La interacción de la proteína BzdR con el promotor PN se ha visualizado mediante la técnica de AFM, confirmando la unión de 4 dímeros de proteína en un complejo rodeado por el DNA a modo de lazo, así como el efecto del benzoil-CoA impidiendo dicha interacción. 15. En los resultados presentados en esta tesis, el modelo de control propuesto para el sistema regulador BzdR/PN es el más completo y mejor estudiado hasta la fecha en el catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos.
DescriptionTesis leida en la Universidad Complutense de Madrid. Facultad de Ciencias Biológicas. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, en 2009. 258 pp
URIhttp://hdl.handle.net/10261/41695
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