Análisis genómico del catabolismo de compuestos aromáticos en Pseudomonas putida KT2440: Caracterización molecular de la ruta de degradación del ácido nicotínico

Abstract

El trabajo descrito a lo largo de esta tesis ha dado lugar a las siguientes conclusiones: 1. El genoma de P. putida KT2440 codifica al menos cinco rutas centrales de catabolismo de derivados bencénicos, i.e., la rama del protocatecuato (genes pca) y del catecol (genes cat) de la ruta del beta-cetoadipato, la del fenilacetato (genes pha), homogentisato (genes hmg) y galato (genes gal), así como los de las rutas periféricas para la degradación de benzoato (genes ben), p-hidroxibenzoato (genes pob), quinato (genes qui), compuestos fenilpropenoides (genes fcs, ech, vdh, cal, van, acd, y acs), fenilalanina/tirosina, (genes phh, tyr y hpd), fenilacetaldehído (gen pad) y fenilalcanoatos (genes fad), que convergen en las correspondiente rutas centrales. Los diferentes agrupamientos génicos no constituyen islas catabólicas en el genoma de la bacteria, tienen un contenido G+C típico de P. putida y muchos de ellos van asociados a secuencias REP. 2. El genoma de P. putida KT2440 codifica la ruta de degradación del ácido nicotínico (NA) siendo la primera que se describe a nivel genético en un organismo. Los genes nic pueden conferir la capacidad de degradar NA a otras cepas de Pseudomonas incapaces de utilizar NA como fuente de carbono. 3. Los genes nicAB codifican la nicotinato hidroxilasa que cataliza la primera etapa de la ruta de degradación de NA con la formación del ácido 6-hidroxinicotínico (6HNA). La enzima de dos componentes NicAB es la primera de estructura primaria conocida capaz de hidroxilar NA. Pertenece a la familia de las molibdeno hidroxilasas pero, a diferencia del resto de proteínas de esta familia la subunidad NicB cuenta con un dominio adicional de tipo citocromo c. La actividad NA hidroxilasa puede ser utilizada para diseñar biocatalizadores para la producción de 6HNA, un importante precursor en la síntesis de insecticidas.

4. El gen nicC codifica la 6HNA monooxigenasa, una flavoproteína que cataliza la descarboxilación oxidativa del 6HNA genrando el metabolito central 2,5-dihidroxipiridina (2,5-DHP).5. El gen nicX codifica una dioxigenasa que convierte la 2,5-DHP en ácido Nformilmaleámico, siendo la primera extradiol dioxigenasa de estructura primaria conocida que se describe en degradación de compuestos derivados de la piridina. NicX representa el primer miembro de una nueva familia de extradiol dioxigenasas con un plegamiento claramente diferente al del resto de las extradiol dioxigenasas caracterizadas y cuya tríada facial de interacción con Fe (II) habría evolucionado a partir del centro activo de ciertas metaloproteasas tales como las aminopeptidasas de la familia MQ. 6. El gen nicD codifica la N-formilmaleámico desformilasa que genera ácido maleámico y fórmico en la ruta de degradación de NA. NicD constituye la primera desformilasa que se describe perteneciente a la superfamilia de proteínas alpha/beta-hidrolasas. 7. Los genes nicF y nicE codifican las dos últimas actividades enzimáticas de la ruta de degradación de NA, es decir, la transformación de ácido maleámico en maleico (con liberación de amonio) y la isomerización de éste a ácido fumárico, respectivamente. Los genes nicT y nicP codifican un presunto transportador de la familia MFS y una porina, respectivamente, que estarán implicados en el transporte de metabolitos de la ruta. 8. Los genes nic se encuentran organizados en tres operones, nicAB, nicXR y nicCDEFTP, inducibles en presencia de 6HNA. El operón nicAB es inducible también por NA. En condiciones de no inducción, los genes nicR y nicTP se expresan también constitutivamente.

9. El producto del gen nicR, un regulador transcripcional de la familia de proteínas MarR, está implicado en la represión (en ausencia de inductor) de los operones nicXR y nicCDEFTP así como en la activación (en presencia de inductor) del operón nicAB.10. Los genes nic parecen ser específicos de P. putida ya que no se han detectado en otras especies de Pseudomonas. La existencia de ortólogos de los genes nic en distintas cepas de Bordetella sugiere la posibilidad de que la ruta nic se haya podido originar en bacterias típicas de suelo para obtener carbono y nitrógeno a partir de NA, y luego haya sido transferida a otros organismos con diferentes estilos de vida y en los que la verdadera función de la degradación de NA todavía no es conocida.