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Title

Análisis comparativo de la expresión e interferecia génica de dos acetilcolinesterasas en Blattella Germanica (L) (Dyctioptera, Blattellidae) y en Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera, Chrysomelidae)

AuthorsRevuelta, Luis
AdvisorTenllado, Francisco ; Hernández-Crespo, Pedro
KeywordsAcetilcolinesterasa
Gen ace1
Gen ace2
Insectos
Insecticidas
Issue Date14-Oct-2011
PublisherUniversidad Politécnica de Madrid
AbstractLa Acetilcolinesterasa (AChE, EC 3.1.1.7) es una enzima esencial en las sinapsis colinérgicas de todos los animales, incluyendo los insectos. La AChE termina el impulso nervioso mediante la hidrólisis rápida del neurotransmisor acetilcolina en el espacio sináptico. En insectos, la AChE ha sido estudiada principalmente en relación con la resistencia a insecticidas, ya que esta enzima es diana de los insecticidas organofosforados y carbamatos y su insensibilidad es uno de los principales factores que conlleva resistencia.
En insectos se ha descrito la existencia de dos genes (ace1 y ace2) que codifican dos subfamilias de acetilcolinesterasas (AChE1 y AChE2, respectivamente).Las evidencias obtenidas hasta la fecha indican que la mayoría de las especies de insectos poseen los dos genes, ace1 y ace2. La excepción se encuentra en las especies del grupo Cyclorrhapha, entre las que se encuentra Drosophila melanogaster, que posiblemente poseen un único gen, ace2. Actualmente, se desconoce el sentido funcional de la existencia de dos AChEs.
A pesar de las evidencias mencionadas, en el escarabajo de la patata,Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), sólo se conoce un gen ace, Ldace2. En la presente tesis doctoral se describe la clonación y la secuenciación de un nuevo gen ace en L. decemlineata (Ldace1). Se ha estudiado la expresión de ambos genes ace, Ldace1 y Ldace2, en diferentes etapas de desarrollo de esta especie. Los niveles de expresión fueron siempre mayores para Ldace1 en comparación con Ldace2.
Además, se utilizó la técnica de Interferencia por RNA (RNAi) para silenciar la expresión de ambos genes de L decemlineata y de Blattella germanica (L.) (Dyctioptera: Blattellidae) mediante la inyección de RNAs bicatenarios (dsRNAs) específicos. El objetivo fue valorar la contribución de cada AChE, AChE1 y AChE2, a la actividad AChE total así como su impacto en la supervivencia del insecto y en la sensibilidad a insecticidas. El silenciamiento de los tránscritos de los genes ace1 o ace2 fue cercano al 100%, siete días después de la inyección. También se observó una reducción de la actividad AChE, aunque menos pronunciada, probablemente debido a la larga vida de esta enzima. La reducción en la actividad AChE fue significativamemte superior en los insectos en los que se silenció la expresión de ace1 (46-49%, según la especie y el tejido) en relación a los insectos en los que se interfirió ace2 (11-16%). Usando medidas espectrofotométricas y zimogramas, se obtuvieron evidencias de que AChE1 representa el 65-75% de la actividad AChE total en el tejido nervioso tanto de L. decemlineata como en B. germanica, demostrándose que el gen ace1 codifica una AChE predominante. Es más, el silenciamiento de la expresión del gen ace1 pero no del gen ace2 en L. decemlineata redujo significativamente la supervivencia del insecto, lo que remarca el papel fisiológico esencial de Ldace1 en la vida de L. decemlineta. Además, en los insectos de las dos especies, L. decemlineata y B. germanica, en los que se silenció ace1 se observó un aumento significativo en la sensibilidad al insecticida organofosforado clorpirifos que no ocurrió cuando se silenció el gen ace2. También, el silenciamiento de la expresión del gen ace1, pero no del gen ace2, produjo un incremento de mortalidad frente al piretroide λ-cialotrina en B. germanica.
Los resultados obtenidos en este trabajo aportan nuevos datos que sugieren que AChE1 contribuye mayormente a la actividad AChE y presenta una función esencial, a nivel cualitativo y/o cuantitativo, como diana de insecticidas en insectos. La función de AChE2 en la fisiología del sistema nervioso de insectos no pertencientes al grupo Cyclorrhapha deberá ser aclarada en estudios posteriores. Este trabajo podrá servir de base para el estudio del RNAi como estrategia directa o complementaria con el uso de insecticidas, para el control de plagas mediante el silenciamiento de genes esenciales del insecto.
[EN]Acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) is an essential enzyme at cholinergic synapses in all animals, including the insects. AChE terminates neurotransmission by rapidly hydrolyzing the neurotransmitter acetylcholine in the synaptic cleft. In insects, AChE has mainly been studied in relation to insecticide resistance because the enzyme is the target of organophosphate and carbamate insecticides and its insensitivity to insecticides is one of the main factors accounting for resistance.
In insects has been described the existence of two genes (ace1 and ace2) coding for two subfamilies of acetylcholinesterase (AChE1 and AChE2, respectively). The evidence obtained to date indicate that most insect species have the two genes, ace1 and ace2. The exception is in Cyclorrhapha group species, among which is D. melanogaster, which may possess a single gene, ace2. The functional sense of these two AChEs is still unclear.
Despite the evidence mentioned, in Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), is only known one, Ldace2. In this thesis we report cloning and sequencing of a new ace gene in L. decemlineata (Ldace1). We have studied the expression of both ace genes, Ldace1 and Ldace2, during different developmental stages of this species. Remarkably, levels of expression were in all cases higher for Ldace1 compared to Ldace2.
Moreover, we used RNA Interference (RNAi) to knockdown the expression of each of the genes from L. decemlineata and Blattella germanica (L.) (Dyctioptera: Blattellidae) through the injection of specific double-stranded RNAs (dsRNAs). The aim was to assess the contribution of each AChE, AChE1 and AChE2, to AChE activity and their impact on insect survival and insecticide sensitivity. The silencing of ace1 or ace2 gene transcripts was close to 100%, seven days after injection. There was also a reduction of AChE activity, although less pronounced, probably due to the long life of this enzyme. The reduction in AChE activity was significantly higher in insects in which was silenced the expression of ace1 (46-49%, depending on species and tissue) in relation to insects in wich was interfered ace2 (11-16% ). Using spectrophotometric and zymogram measurements, we obtained evidence that AChE1 represents 65-75% of the total AChE activity in nerve tissue of L. decemlineata and B. germanica demonstrating that ace1 encodes a predominant AChE. Furthermore, silencing the expression of ace1 but not ace2 in L. decemlineata significantly reduced the survival of the insect, highlighting the essential role played by ace1 in L. decemlineata life cycle. Furthermore, in insects of the two species, L. decemlineata and B. germanica, in which ace1 was silenced, a significant increase in sensitivity to the organophosphate insecticide chlorpyrifos was observed, but did not happen when the ace2 gene was silenced. Silencing the expression of ace1 but not ace2 in B. germanica also produced an increased mortality in insects when synergized with the pyrethroid λ-cyhalothrin.
The results obtained in this study provide additional evidence suggesting that AChE1 contributes predominantly in AChE activity and has an essential function, in a qualitative and/or quantitative level, as target of insecticides in insects. The function of AChE2 in the physiology of the nervous system of insects within non-Cyclorrhapha group must be clarified in future studies. This work may provide a basis for the study of RNAi as a direct strategy or complementary strategy to the use of insecticides for pest control through the silencing of essential genes of the insect.
DescriptionRealizado el acto de defensa y lectura de Tesis el día 12 de Enero de 2010. En la E.T.S. Ingenieros Agrónomos.x,198 págs.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/41110
Appears in Collections:(CIB) Tesis
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