Interacciones de oligomanósidos con el anticuerpo 2G12 (Anti VIH-1) estudios por RMN y modelización molecular

Abstract

En esta tesis doctoral, se ha abordado el estudio de las interacciones en disolución entre una serie de oligomanósidos, que representan estructuras parciales del glicano tipo high-mannose,y el anticuerpo 2G12, y la evaluación de sus afinidades. Para ello se han empleado, de forma extensiva, técnicas de RMN (fundamentalmente STD NMR5 y NOE-transferido17) basadas en el análisis de las señales espectroscópicas del ligando (oligomanósidos) cuando éste interacciona con su receptor (2G12). Mediante estas técnicas, nos propusimos, como primer objetivo, identificar a nivel atómico aquellos contactos oligomanósido/anticuerpo que resultan claves en la interacción 2G12/gp120, tratando de abordar el sistema natural desde un punto de vista reduccionista en el que dichas interacciones se analizan haciendo uso de oligomanósidos sintéticos de composición química definida, que se han seleccionado de la “plantilla” de los glicanos high-mannose naturales (figura 1). La determinación de la estructura de los epítopos del antígeno resulta de interés para el desarrollo de futuros agentes inmunogénicos capaces de generar la producción de anticuerpos tipo-2G12 en el organismo humano. El desarrollo de este objetivo esta descrito en el capítulo 2 de esta tesis. Una vez establecidos los modos de asociación entre el 2G12 y los distintos oligomanósidos, nos planteamos el problema concreto de la determinación de sus constantes de afinidad en disolución, mediante titulaciones de un solo ligando monitorizadas por espectroscopía de STD NMR. La caracterización de las afinidades de los diferentes ligandos por el anticuerpo 2G12 ha requerido de un estudio detallado de los factores que afectan a esta clase de medidas en disolución mediante dicha técnica espectroscópica. Cuando comenzamos este trabajo, no era posible la determinación precisa de valores de afinidad ligando-proteína por dicha técnica. El segundo objetivo que nos propusimos en esta Tesis fue, por tanto, hacer un estudio de los distintos parámetros que afectan a las medidas, utilizando para ello sistemas modelo de interacción ligando/proteína, y diseñar protocolos apropiados para poder cancelar dichos factores, cuya influencia puede repercutir en un incremento considerable de los errores experimentales de las medidas. Así, esperábamos obtener las constantes de afinidad 2G12/oligomanósidos mediante la técnica STD NMR con la mayor precisión posible. El desarrollo de este objetivo y sus resultados se presentan en el capítulo 3. En un marco más amplio, y gracias a la experiencia del grupo en la síntesis de gliconanopartículas con núcleo metálico,18 hemos utilizado gliconanopartículas de oro funcionalizadas con los mismos oligomanósidos, para estudiar las interacciones entre éstas y el anticuerpo 2G12 con la ayuda de experimentos de inhibición competitiva. Las gliconanopartículas constituyen sistemas multivalentes15 que mimetizan las agrupaciones de los glicanos tipo high-mannose de la gp120, y que probablemente sean el origen de la respuesta del sistema inmune que genera el 2G12 frente al VIH. Los resultados obtenidos en el desarrollo de este tercer objetivo se describen en el capítulo 4 de esta tesis. Hemos creído conveniente en este primer capítulo introducir, en primer lugar, de forma breve, las bases moleculares de las interacciones carbohidrato/proteína en las que se centra esta tesis, y, por último, una descripción de las técnicas de RMN y cálculos teóricos que se han utilizado a lo largo de este trabajo de investigación.