Efecto de la vacunación sobre la protección y la respuesta inmunitaria frente a la paratuberculosis en modelos experimentales in vitro e in vivo de pequeños rumiantes

Abstract

[EN] Paratuberculosis is a chronic disease of ruminants caused by the intracellular bacteria Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map). Currently, vaccination has been considered the most cost-effective control method that achieves a reduction on the onset of new clinical cases and the fecal shedding of bacilli. However, its protective effect is incomplete and how it influences the pathogenesis of the disease and the immune response of the host is still not fully understood. Furthermore, vaccination against paratuberculosis has been associated with a nonspecific protective effect against other infections, related or not to mycobacteria, a phenomenon that could be caused by the establishment of what is known as a trained immune response. This response is mediated by cells of the innate immune response, such as macrophages, the target cells cells of Map, or neutrophils. Bearing in mind the reduced number of works aimed at studying the characteristics of the protective response induced by paratuberculosis vaccination, the general objective of this Doctoral Thesis is to investigate its influence on the immune response of the host, attempting to clarify those factors related to protection. Subsequently, in order to carry out in vitro studies on the effect of vaccination on the activity of neutrophils and macrophages, the first study of this Thesis was aimed to the establishment of a standardized and effective protocol for the simultaneous isolation of mononuclear cells from peripheral blood (PBMCs) and neutrophils, as well as the purification of monocytes and the obtaining of monocyte-derived macrophages (MDMs) from peripheral blood of sheep and goats. For that purpose, different isolation or purification methods were compared, as well as culture conditions for the maturation of monocytes. The estimation of the yield of each protocol, the purity and the phenotypic characteristics of the cell populations obtained were determined by cell counting in a Neubauer chamber, microscopy and flow cytometry. The mixture of the buffy coat and red cell layers during the Lymphoprep™ separation allowed the isolation of a large number of PBMCs and neutrophils with a high purity from the same blood sample. Besides, it was observed that the immunomagnetic columns provide a high monocyte yield (number of monocytes/initial number of PBMCs) with high purity, also determined by the percentage of CD14+, MHC-II+ and CD11b+ cells. These values were higher than those found in adherence-purified monocytes, due to the presence of a greater number of contaminating lymphocytes using the latter, which, however, did not interfere in the maturation of monocytes to macrophages, since the final number of MDMs was higher in monocytes isolated by adherence. Subsequently, the supplementation of monocyte cultures with increasing concentrations of GM-CSF, proportionally increased the number of MDMs compared to the incubation with autologous serum. Therefore, following the protocol established in this study, it is possible to perform the simultaneous isolation of PBMCs and neutrophils with high efficiency and purity. Likewise, these PBMCs are suitable for the purification of monocytes and the obtaining of MDMs with any of the purification techniques analyzed, according to the needs of the experiment, and following the established maturation conditions. In this case, the adherence technique was chosen for the purification of monocytes as it was the one that provided a greater number of MDMs.

The second study of the Thesis was focused on the assessment of the effect of the inactivated Silirum® vaccine on the immune response generated in macrophages one month after vaccination. CaMØs (goat MDMs) from goats vaccinated and non-vaccinated with Silirum® and infected in vitro with Map were used, whereupon the viability of Map and its quantification by bacteriological culture and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) were determined, respectively. In addition, the expression levels of different pro and anti-inflammatory cytokines and iNOS were also analyzed by reverse transcription (RT-qPCR), and the number of infected CaMØs, as well as the degree of infection, were estimated by immunofluorescence. These assays reflected a significant reduction in the viability of Map in the supernatants and CaMØs from vaccinated goats, which was accompanied by the presence of a higher percentage of infection and a higher number of internalized bacteria in the CaMØs of this same group in comparison with the non-vaccinated ones. In addition, CaMØs from vaccinated animals showed higher expression of iNOS (pro-inflammatory action) and IL-10 (anti-inflammatory), while only MIP-β (pro-inflammatory) expression was increased in non-vaccinated animals. These results suggest that vaccination against paratuberculosis modifies the response of CaMØs, so they increase their phagocytic and antimicrobial capacity against Map, which is associated with a greater production of cytokines with both pro and anti-inflammatory action.

The purpose of the third study of the Thesis was to assess the effect of the administration of Silirum® on the generation of extracellular neutrophil traps (NETs) in response to in vitro infection with Map and other non-mycobacterial pathogens. For this reason, blood neutrophils from vaccinated and non-vaccinated sheep were isolated and infected in vitro with Map, Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The formation of NETs was analyzed by visualization of DNA, myeloperoxidase and elastase by immunofluorescence microscopy and a quantification of extracellular DNA (PicoGreen™) was carried out by fluorimetry. These assays demonstrated that Map infection is able to stimulate the release of NETs, although to a lesser extent than S. aureus and E. coli. However, no differences were detected between vaccinated and non-vaccinated sheep, regardless of infection and post-vaccination days. These results suggest that the release of NETs would not play an important role in the protective immune response after vaccination against paratuberculosis, at least during the first month after vaccination.

However, it is possible that other antimicrobial mechanisms developed by these cells and not analyzed in this study may be involved in this response. The objective of the fourth and last study was the evaluation of the effect of homologous (against paratuberculosis) or heterologous (against tuberculosis) vaccination on the immune response and protection in goat kids experimentally infected with Map, discerning the effect of each of the components of these vaccines. For this purpose, one-month-old kids were divided into several groups according to vaccination (Silirum®, HIMB-inactivated vaccine against Mbv or non-vaccinated), immunization (inactivated bacteria or adjuvants) and/or infection. At 45 days post-vaccination, animals were orally infected with Map and, subsequently, sacrificed at 190 days post-vaccination. Monthly, blood samples were collected for determination of peripheral immune response and the proportion of lymphocyte subpopulations by IFN-γ release test (IGRA), antibody detection (ELISA), and flow cytometry, respectively. In addition, after sacrifice, fecal samples (bacteriological culture) and intestinal tissue and associated lymph nodes were collected for the assessment of the local production of IFN-γ (IGRA), the detection of Map (qPCR and bacteriological culture), the study of lymphocyte subpopulations (flow cytometry) and histological examination. Granulomatous lesions were detected in all the infected groups, regardless of vaccination or immunization. However, in those vaccinated with Silirum® (against Map) or HIMB (against Mbv), a considerable reduction in the number and severity of these lesions was recorded, which was accompanied by a heightened cellular and peripheral humoral responses. There was also a decrease in the number of granulomas in the animals immunized with the vaccine strains and adjuvants compared to the non-vaccinated and infected group. It should be noted that this reduction was even greater in goats in which only the adyuvant was administered, compared to those that were immunized with vaccine strains. Besides, no differences were observed in the peripheral or local proportion of the different subpopulations of lymphocytes, nor in the local immune response, between the established groups. In the light of these results, both vaccination against paratuberculosis and tuberculosis induced homologous and heterologous protection, respectively, against Map infection. Furthermore, the animals immunized with the adjuvants experienced a reduction in the number of lesions, not associated with the presence of a specific immune response against Map, which could be mediated by a nonspecific immunity mechanism that needs to be elucidated.

[ES] La paratuberculosis es una enfermedad crónica de los rumiantes causada por la bacteria intracelular Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (Map). Hasta el momento, la vacunación ha sido considerada el método de control con una mejor relación coste-beneficio, al reducir la aparición de nuevos casos clínicos y la excreción fecal de bacilos. No obstante, su efecto protector es incompleto y aún no se conoce en profundidad cómo influye sobre la patogenia de la enfermedad y la respuesta inmunitaria del hospedador. Además, la vacunación frente a paratuberculosis se ha asociado con un efecto protector inespecífico frente a otras infecciones, relacionadas o no con micobacterias, un fenómeno que podría ser causado por el establecimiento de lo que se conoce como respuesta inmunitaria entrenada. Esta respuesta esta mediada por células de la respuesta inmunitaria innata, como los macrófagos, células dianas de Map, o los neutrófilos. Teniendo en cuenta el número limitado de trabajos destinados a estudiar las características de la respuesta protectora tras la vacunación, el objetivo general de esta Tesis Doctoral consiste en investigar su influencia en la respuesta inmunitaria del hospedador, tratando de esclarecer aquellos factores relacionados con la protección. Para poder realizar posteriormente estudios in vitro sobre el efecto de la vacunación en la actividad de neutrófilos y macrófagos, el primer estudio de esta Tesis consistió en establecer un protocolo estandarizado y efectivo para el aislamiento simultáneo de células mononucleares a partir de sangre periférica (PBMCs) y neutrófilos, así como la purificación de monocitos y la obtención de macrófagos derivados de monocitos (MDMs), a partir de sangre periférica de ovejas y de cabras. Para ello, se compararon distintas técnicas de aislamiento o purificación, así como diversas condiciones de cultivo para la maduración de monocitos. La estimación del rendimiento de cada protocolo, la pureza y las características fenotípicas de las poblaciones celulares obtenidas se determinaron mediante recuento celular en cámara de Neubauer, microscopía y citometría de flujo. La mezcla de las capas de leucocitos y de células rojas durante la separación con Lymphoprep™ permitió aislar un gran número de PBMCs y neutrófilos con una elevada pureza a partir de la misma muestra de sangre. Por otro lado, se observó que las columnas inmunomagnéticas proporcionan un buen rendimiento (nº monocitos/nº inicial de PBMCs) en la obtención de monocitos con una elevada pureza, determinado también mediante el porcentaje de células CD14+, CMH-II+ y CD11b+. Estos valores fueron superiores a los encontrados en los monocitos purificados mediante adherencia, debido a la presencia de un mayor número de linfocitos contaminantes empleando esta última técnica que, sin embargo, no interfirió en la maduración de monocitos a macrófagos, ya que el número final de MDMs fue superior en los monocitos aislados mediante adherencia. Posteriormente, la suplementación de los cultivos de monocitos con concentraciones crecientes de GM-CSF incrementó de manera proporcional el número de MDMs en comparación con el suero autólogo. Por lo tanto, siguiendo el protocolo establecido en este estudio es posible realizar el aislamiento simultáneo de PBMCs y neutrófilos con una elevada eficiencia y pureza. Así mismo, estos PBMCs son aptos para la purificación de monocitos y la obtención de MDMs con cualquiera de las técnicas analizadas, según las necesidades del experimento y siguiendo las condiciones de maduración establecidas. En este caso, se eligió la técnica de adherencia para la purificación de monocitos por ser la que proporcionó un mayor número de MDMs.

El segundo estudio de la Tesis se centró en estudiar el efecto de la vacuna inactivada Silirum® sobre la respuesta inmunitaria generada en los macrófagos un mes después de la vacunación. Se emplearon CaMØs (MDMs caprinos) procedentes de cabras vacunadas con Silirum® y sin vacunar, e infectadas in vitro con Map, tras lo cual se determinó la viabilidad de Map y su cuantificación mediante cultivo bacteriológico y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), respectivamente. Además, también se analizaron los niveles de expresión de distintas citoquinas pro y antiinflamatorias e iNOS mediante PCR con transcripción inversa (RT-qPCR) y se estimó el número de CaMØs infectados, así como el grado de infección, mediante inmunofluorescencia. Estas pruebas reflejaron una reducción significativa de la viabilidad de Map en los sobrenadantes y los CaMØs procedentes de las cabras vacunadas, que se acompañaba de un mayor porcentaje de infección y un mayor número de bacterias internalizadas en los CaMØs de este mismo grupo en comparación con los no vacunados. Además, los CaMØs procedentes de animales vacunados mostraban una mayor expresión de iNOS (acción proinflamatoria) e IL-10 (antiinflamatoria), mientras que solo la expresión MIP-β (proinflamatoria) se encontraba elevada en los animales no vacunados. Estos resultados sugieren que la vacunación frente a paratuberculosis modifica la respuesta de los CaMØs, de forma que aumentan su capacidad fagocítica y antimicrobiana frente a Map, lo que aparece asociado a una mayor producción de citoquinas con acción tanto pro como antiinflamatoria.

El tercer estudio de la Tesis tuvo como fin valorar el efecto de la administración de Silirum® sobre la generación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) en respuesta a la infección in vitro con Map y otros patógenos no relacionados con micobacterias. Para ello, se utilizaron ovejas vacunadas y sin vacunar, a partir de las cuales se aislaron neutrófilos sanguíneos que fueron infectados in vitro con Map, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Se analizó la formación de NETs por medio de la visualización mediante inmunofluorescencia del ADN, la mieloperoxidasa y la elastasa, y se llevó a cabo una cuantificación del ADN extracelular (PicoGreen™) mediante fluorimetría. Estas pruebas demostraron que la infección con Map es capaz de estimular la liberación de NETs, aunque en menor medida que S. aureus y E. coli. No obstante, no se detectaron diferencias entre las ovejas vacunadas y las no vacunadas, independientemente de la infección y del tiempo post-vacunación. Estos resultados sugieren que la liberación de NETs no jugaría un papel importante en la respuesta inmune protectora tras la vacunación frente a paratuberculosis, al menos durante el primer mes post-vacunación. No obstante, es posible que otros mecanismos antimicrobianos desarrollados por estas células y no analizados en este estudio, puedan estar implicados en esta respuesta.

El cuarto y último estudio consistió en valorar el efecto que tiene la vacunación homóloga (frente a paratuberculosis) o heteróloga (frente a tuberculosis) sobre la respuesta inmunitaria y la protección en cabritos infectados de forma experimental con Map, y conocer el papel que puede jugar cada uno de los componentes de estas vacunas. Con este fin, se emplearon cabritos de un mes de edad divididos en varios grupos en función de la vacunación (Silirum®, HIMB-vacuna inactivada frente a Mbv o no vacunados), inmunización (bacterias inactivadas o adyuvantes) y/o infección. A los 45 días post-vacunación, los animales fueron infectados oralmente con Map y, posteriormente, sacrificados a los 190 días post-vacunación. Mensualmente, se recogieron muestras de sangre para la determinación de la respuesta inmunitaria periférica y la proporción de subpoblaciones linfocitarias mediante la prueba de liberación de IFN-γ (IGRA) o la detección de anticuerpos (ELISA), y citometría de flujo, respectivamente. Además, tras el sacrificio, se recogieron muestras de heces (cultivo bacteriológico) y de intestino y nódulos linfáticos asociados para la valoración de la producción local de IFN-γ (IGRA), la detección de Map (qPCR y cultivo bacteriológico), el estudio de las subpoblaciones linfocitarias (citometría de flujo) y el examen histológico. En todos los grupos de animales infectados se observaron lesiones granulomatosas, independientemente de la vacunación o la inmunización. Sin

embargo, los grupos vacunados con Silirum® (frente a Map) o HIMB (frente a Mbv) mostraron una considerable reducción del número y la gravedad de dichas lesiones, que se acompañaba de una elevada respuesta celular y humoral periféricas. También se observó una disminución del número de granulomas en los animales inmunizados con las cepas vacunales y los adyuvantes en comparación con el grupo no vacunado e infectado. Cabe destacar que esta reducción fue incluso mayor en las cabras a las que se les administró el adyuvante, en comparación con aquellas que fueron inmunizadas con cepas vacunales. Por otro lado, no se observaron diferencias en la proporción periférica o local de las diferentes subpoblaciones de linfocitos, ni en la respuesta inmunitaria local, entre los grupos establecidos. A la luz de estos resultados, tanto la vacunación frente a paratuberculosis como a tuberculosis ofreció una protección homóloga y heteróloga, respectivamente, contra la infección por Map. Además, los animales inmunizados con el adyuvante experimentaron una reducción del número de lesiones, no asociada a la presencia de una respuesta inmunitaria específica frente a Map detectable, que podría estar mediada por un mecanismo de inmunidad inespecífica que necesita ser esclarecido.