Carbohidratos prebióticos: mecanismos de digestión, modulación de la microbiota y síntesis de nuevos oligosacáridos

Abstract

[ES] Dado el papel esencial de la microbiota intestinal en el organismo humano, su modulación resulta imprescindible, siendo los prebióticos unos de los compuestos más importantes que contribuyen a mantener su equilibrio y estado de salud. Aunque se han llevado a cabo numerosas investigaciones sobre los prebióticos y la microbiota, no ha sido hasta muy recientemente cuando se ha prestado atención a su digestión. Los métodos tradicionales de digestión de ingredientes y alimentos se centran principalmente en proteínas y almidón, siendo el protocolo InfoGest, basado en el empleo de soluciones digestivas, el más ampliamente aceptado. Además, existen otros tales como el método oficial de la Asociación Oficial de Química Analítica, más específico para fibra dietética. Las limitaciones de estos métodos para la digestión de carbohidratos podrían sustentarse en la ausencia de las enzimas disacaridasas presentes en la membrana del borde en cepillo de los enterocitos, no permitiendo distinguir entre carbohidratos digeribles y no digeribles. Estudios previos de nuestro grupo de investigación demostraron la idoneidad de un método in vitro basado en la utilización de un extracto acétonico de intestino delgado de rata para evaluar la digestibilidad de carbohidratos de la dieta y prebióticos reconocidos. A pesar de los resultados prometedores, no se estudió la cinética enzimática y su aplicación a carbohidratos más complejos. El primer bloque de la presente Tesis Doctoral se basa en la ampliación del conocimiento sobre este método in vitro con extracto de intestino delgado de rata para evaluar la digestibilidad de carbohidratos prebióticos, y su comparación con el protocolo InfoGest (Capítulos 1-3). En primer lugar, se realizó un estudio cinético de las enzimas intestinales de dicho extracto de rata, optimizándose las condiciones de máxima hidrólisis de un disacárido digerible (lactosa). Además, se observó la elevada resistencia a las enzimas intestinales de la lactulosa, prebiótico reconocido, remarcando la importancia de la estructura química. Seguidamente, dado que la mayoría de carbohidratos prebióticos estudiados en la literatura eran de baja masa molecular, se analizaron mezclas complejas de prebióticos comerciales de mayor masa molecular, como fructanos y oligosacáridos emergentes, como α-galactooligosacáridos. Los resultados indicaron una potencial versatilidad enzimática por parte de las disacaridasas, ya que fueron capaces de hidrolizar diferentes enlaces químicos de los prebióticos. A continuación, se consideró necesario hacer una comparación con el protocolo InfoGest en polisacáridos, como almidón y pectinas. Mediante el método InfoGest apenas se consiguió degradación de los carbohidratos en las diferentes fases del proceso. En cambio, la hidrólisis intestinal de todos los compuestos se vio siempre incrementada significativamente en presencia del extracto de intestino delgado de rata, lo que podría suponer una aproximación más real a la digestión intestinal. El efecto de las pectinas sobre la microbiota intestinal fue evaluado mediante un ensayo in vivo, tanto en ratas sanas como con cáncer colorrectal, tal y como se muestra en el segundo bloque de la Tesis Doctoral (Capítulo 4). En las ratas enfermas se detectó un estado de disbiosis en la microbiota intestinal que no mejoró con la ingestión de pectinas de cítricos; sin embargo, sí se encontró un efecto positivo en cuanto al nivel de triglicéridos en sangre y glucemia. Por otra parte, el creciente interés en la obtención de nuevos prebióticos con propiedades bioactivas adicionales dio lugar al tercer bloque de la Tesis, que abarca la síntesis de derivados de la trehalosa (Capítulo 5). La trehalosa, ingrediente alimentario ampliamente utilizado, posee efectos beneficiosos en la salud metabólica y frente a enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, puede llegar al colon y ejercer efectos negativos, en el caso de infecciones por Clostridium difficile. En este último capítulo se llevó a cabo la síntesis, purificación y caracterización de nuevos oligosacáridos derivados de trehalosa con potencial prebiótico. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral amplian los conocimientos existentes en el campo de los prebióticos, con especial énfasis en la aplicación de métodos de digestión específicos y válidos para carbohidratos digeribles y no digeribles de diferente grado de polimerización y enlaces glicosídicos; y en la síntesis de nuevas moléculas, teóricamente más resistentes a la digestión, con importantes propiedades, no sólo a nivel intestinal.

EN] Given the essential role of the intestinal microbiota in the human organism, its modulation is essential, and prebiotics are one of the most important compounds that contribute to maintaining its balance and state of health. Although several investigations have been carried out on prebiotics and microbiota, it is, nowadays, when more attention has been paid to their digestion. Traditional methods of ingredients and food digestion focus mainly on protein and starch, being the InfoGest protocol, the most widely accepted, and based on the use of digestion solutions. In addition, there are others such as the official method of the Association of Official Analytical Chemists, which is more specific for dietary fiber. The limitations of these methods for carbohydrate digestion could be due toon the absence of the disaccharidases enzymes present in the brush border membrane of the enterocytes, and therefore, they do not allow to distinguish between digestible and non-digestible carbohydrates. Previous work of our research group demonstrated the suitability of an in vitro method based on the use of an acetonic powder extract from rat small intestine to assess the digestibility of dietary carbohydrates and recognized prebiotics. Despite promising results, enzyme kinetics and their application to more complex carbohydrates were not investigated. The first part of the present PhD Thesis is based on the extension of knowledge about this in vitro method with rat small intestine extract to evaluate the digestibility of prebiotic carbohydrates, and its comparison with the InfoGest protocol (Chapters 1-3). Firstly, a kinetic assay of the intestinal enzymes of this rat extract was performed, optimizing the conditions of maximum hydrolysis of a digestible disaccharide (lactose). In addition, lactulose, a recognized prebiotic, showed high resistance to intestinal enzymes, highlighting the high dependence on the chemical structure. Then, since most of the tested prebiotic carbohydrates had low molecular weight, complex mixtures of commercial prebiotics of higher molecular weight, such as fructans; and emerging oligosaccharides, such as α-galactooligosaccharides, were analyzed. Results indicated a potential enzymatic versatility by the intestinal disaccharidases, as they were able to hydrolyze different chemical bonds of prebiotic components. Following this, it seems imperative to perform a comparison with the InfoGest protocol on those compounds with higher molecular weight, such as starch and pectins. Using the InfoGest method, hardly any carbohydrate digestion was achieved in the different stages of digestion. By contrast, intestinal hydrolysis in all compounds was always significantly increased in the presence of the rat small intestine extract, which may suggest a more realistic more realistic approach to ileal digestion. The effect of pectins on the intestinal microbiota was evaluated by an in vivo assay, both in healthy rats and in rats with colorectal cancer, as it is shown in the second part of this PhD Thesis (Chapter 4). In diseased rats, a general dysbiosis data was detected in the intestinal microbiota that did not improve with the intake of citrus pectins; however, a positive effect was found in terms of blood triglyceride and glycaemia levels. On the other hand, the growing interest in obtaining new prebiotics with additional bioactive properties gave rise to the third part of this PhD Thesis, involving the synthesis of trehalose derivatives (Chapter 5). Trehalose, a widely used food ingredient, has beneficial effects on metabolic health and against neurodegenerative diseases. This compound can reach the colon and cause adverse effects, due to the Clostridium difficile infections. In this last chapter, the synthesis, purification and characterization of new trehalose-derived oligosaccharides with prebiotic potential was carried out. Results obtained in this PhD Thesis spread the existing knowledge in the field of prebiotics, with special emphasis on the application of specific and valid digestion methods for digestible and non-digestible carbohydrates of different degree of polymerization and glycosidic bonds; and in the synthesis of new molecules, theoretically more resistant to digestion, with important properties, not only at the intestinal level.