Caracterización de dos activadores transcripcionales: MafR de Enterococcus faecalis y MgaP de Streptococcus pneumoniae

Abstract

[EN]The Gram-positive bacteria Enterococcus faecalis and Streptococcus pneumoniae are inhabitants of the human body. Whereas E. faecalis is a usual commensal of the gastrointestinal tract, S. pneumoniae is normally found in the nasopharynx of healthy individuals. Nevertheless, their ability to adapt to diverse stress conditions allows them to invade other niches of the human host causing a variety of life-threatening infections. In general, bacterial adaptation to new niches requires the action of proteins that act as global transcriptional regulators. These proteins activate and/or repress the transcription of multiple genes in response to specific signals. The Mga/AtxA family of global transcriptional regulators includes various proteins of Gram-positive pathogenic bacteria: AtxA (Bacillus anthracis), Mga (S. pyogenes), MgaSpn (S. pneumoniae), and MafR (E. faecalis). Several studies have shown that these transcriptional regulators play a role in bacterial virulence (Fouet, 2010; Hemsley et al., 2003; McIver, 2009; Ruiz-Cruz et al., 2016). MafR from Enterococcus faecalis Previous studies in our laboratory showed that the MafR protein of E. faecalis strain V583 (MafRV583) binds to linear DNA fragments generating multimeric complexes, and this binding has little or no sequence specificity (Ruiz-Cruz, 2015). Furthermore, using microarrays designed for strain OG1RF, it was shown that MafR activates, directly or indirectly, the transcription of at least 87 genes. Many of them are organized in operons and encode proteins involved in the utilization of carbon sources (Ruiz-Cruz et al., 2016). In this Thesis, we have worked on the following objectives: (a) Analysis of the DNA-binding properties of MafR from strain OG1RF (MafROG1RF) and (b) Identification of genes regulated directly by MafROG1RF. Results and Conclusions Compared to MafRV583, MafROG1RF has five amino acid changes, and three of them (Ala37Thr, Gln131Leu, Met145Thr) are located within the predicted DNA-binding domain (residues 11 to 164). We have purified a His-tagged version of MafROG1RF (MafROG1RF-His), as well as a variant of MafROG1RF-His that lacks the first three amino acid residues (MafROG1RFΔ3N-His). By gel retardation experiments, we have shown that MafROG1RF-His, but not MafROG1RFΔ3N-His, generates multimeric complexes on different linear DNA fragments. Thus, neither the presence of the His-tag at the C-terminus nor the amino acid substitutions affect the DNA-binding behaviour of MafR. However, removal of the first three residues results in a variant unable to interact with DNA, which suggests that such residues are crucial for its structure and/orfunction. Formation of multimeric complexes on linear DNA fragments has also been reported for the pneumococcal MgaSpn transcriptional regulator (Solano-Collado et al., 2013).

By qRT-PCR, primer extension, transcriptional fusions and DNase I footprinting assays, we have demonstrated that MafR activates directly the transcription of OG1RF_12294, OG1RF_11486 and OG1RF_10478 genes. These genes are predicted to be involved in calcium transport, uptake of a queuosine precursor and cellobiose transport, respectively, which suggests a regulatory role of MafR in such processes. Furthermore, we have shown that MafR increases the efficiency of its target promoters by binding to a specific site that overlaps the -35 element. The three MafR-binding sites identified in this work exhibit a low sequence identity. They are located at or flanked by regions of potential bendability. We propose that MafR could use a shape readout mechanism to achieve DNA-binding specificity. MgaP from Streptococcus pneumoniae S. pneumoniae strain R6 has several gene clusters that are not present in strain TIGR4 (Brückner et al., 2004). One of them contains two genes that are divergently transcribed, spr1403 (pclA) and spr1404 (here named mgaP). Analyses of the distribution of this gene cluster among numerous clinical isolates revealed that it is a strain-specific gene cluster (Imai et al., 2011; Paterson et al., 2008). Searching for homologies, we found that MgaP has sequence similarity (60.3%) with the pneumococcal MgaSpn regulator, a member of the Mga/AtxA family that is present in both strains TIGR4 and R6 (Hemsley et al., 2003; Solano-Collado et al., 2012). In this Thesis, we have worked on the following objectives: (a) Expression analysis of the mgaP gene in S. pneumoniae R6, (b) Study of the effect of MgaP on the transcription of the pclA gene (pneumococcal collagen-like protein A), and (c) To analyse whether MgaP and MgaSpn have common features in their interaction with DNA. Results and Conclusions By qRT-PCR, we have shown that mgaP is transcribed under laboratory conditions. Compared to the stationary phase, transcription of the mgaP gene is higher at logarithmic phase. In addition, by primer extension and transcriptional fusions, we have shown that transcription of mgaP is initiated at the PmgaP promoter, which does not seem to be self-regulated.We have demonstrated that MgaP is a transcriptional activator. First, using pneumococcal strains that synthesize different levels of MgaP, we have shown that MgaP increases the transcription level of the pclA gene (qRT-PCR), as well as the activity of the PpclA promoter (transcriptional fusions).

This activation requires a region located upstream of the PpclApromoter (positions -76 to -106). Furthermore, by DNase I footprinting assays and using a Histagged version of MgaP (MgaP-His), we have established that MgaP recognizes a specific site upstream of the PpclA promoter (positions -68 to -169). Previous studies in our laboratory showed that MgaSpn enhances the activity of the P1623B promoter by binding to a specific site upstream of the core promoter (positions -60 to -99) (Solano-Collado et al., 2013). Now, by in silico analyses, we have found that MgaP and MgaSpn exhibit a similar domain organization. In addition, by gel retardation assays, we have shown that, like MgaSpn, MgaP binds to linear DNA fragments in a non-sequence-specific manner and generates multimeric complexes. Nonetheless, by DNase I footprinting experiments, we have demonstrated that theses proteins have different DNA-binding specificities. MgaP does not recognize the MgaSpn binding site and vice versa.

[ES]Las bacterias Gram-positivas Enterococcus faecalis y Streptococcus pneumoniae son habitantes naturales del ser humano. E. faecalis es un comensal del tracto gastrointestinal, mientras que S. pneumoniae puede encontrarse en la nasofaringe de individuos sanos. Sin embargo, su capacidad de adaptación a condiciones adversas les permite colonizar otros nichos y causar infecciones graves. En general, estos procesos de adaptación requieren la acción de proteínas que actúan como reguladores globales de la transcripción. Estas proteínas activan y/o reprimen la transcripción de numerosos genes en respuesta a señales ambientales específicas. La familia de reguladores globales conocida como Mga/AtxA incluye varias proteínas de bacterias patógenas Gram-positivas: AtxA (Bacillus anthracis), Mga (S. pyogenes), MgaSpn (S. pneumoniae) y MafR (E. faecalis). Varios estudios indican que estos reguladores transcripcionales están involucrados en la virulencia de estas bacterias (Fouet, 2010; Hemsley et al., 2003; McIver, 2009; Ruiz-Cruz et al., 2016). MafR de Enterococcus faecalis Estudios previos de nuestro laboratorio mostraron que la proteína MafR de E. faecalis V583 (MafRV583) se une a fragmentos de ADN lineal generando complejos multiméricos y que esta unión tiene poca o ninguna especificidad de secuencia (Ruiz-Cruz, 2015). Además, mediante microarrays diseñados para la estirpe OG1RF, se observó que MafR activa, directa o indirectamente, la transcripción de al menos 87 genes. Muchos de estos genes están organizados en operones y codifican proteínas implicadas en la utilización de fuentes de carbono (Ruiz-Cruz et al., 2016). En esta Tesis, hemos trabajado en los siguientes objetivos: (a) Análisis de las propiedades de unión a ADN de la proteína MafR de la estirpe OG1RF (MafROG1RF) y (b) Identificación de genes regulados directamente por MafROG1RF. Resultados y Conclusiones MafROG1RF difiere de MafRV583 en cinco aminoácidos, tres de ellos (Ala37Thr, Gln131Leu, Met145Thr) localizados en el supuesto dominio de unión a ADN (residuos 11 a 164). Hemos purificado una versión de MafROG1RF con cola de histidinas (MafROG1RF-His), así como una variante de MafROG1RF-His que carece de los tres primeros aminoácidos (MafROG1RFΔ3N-His). Mediante experimentos de retraso en gel, hemos observado que MafROG1RF-His, al contrario que MafROG1RFΔ3N-His, genera complejos multiméricos en diferentes fragmentos de ADN lineal. Por consiguiente, ni la presencia de la cola de histidinas en el extremo C-terminal, ni las sustituciones aminoacídicas afectan la unión de MafR al ADN.

Sin embargo, la deleción de los tres primeros aminoácidos resulta en una variante incapaz de interaccionar con el ADN, lo cual sugiere que esos residuos son cruciales para la estructura y/o función de la proteína. La formación de complejos multiméricos en fragmentos de ADN lineal ha sido también descrita para el regulador transcripcional MgaSpn de neumococo (Solano-Collado et al., 2013). Mediante técnicas de qRT-PCR, primer extension, fusiones transcripcionales y footprinting con DNasa I, hemos demostrado que MafR activa directamente la transcripción de los genes OG1RF_12294, OG1RF_11486 y OG1RF_10478. Según la predicción de programas bioinformáticos, estos genes estarían involucrados en el transporte de calcio, en la incorporación de un precursor de la queuosina y en el transporte de celobiosa, respectivamente, lo que sugiere que MafR tiene un papel regulador en estos procesos. También, hemos demostrado que MafR incrementa la actividad de sus promotores diana uniéndose a un sitio específico que solapa con el elemento -35. Los tres sitios de unión de MafR identificados en este trabajo muestran una identidad de secuencia baja y están localizados en, o flanqueados por, regiones de posible bendability. Proponemos que MafR reconoce sitios específicos del ADN por un mecanismo que implica el reconocimiento de características estructurales del ADN (shape readout mechanism). MgaP de Streptococcus pneumoniae La estirpe R6 de S. pneumoniae posee varios clústeres genéticos que no se encuentran en la estirpe TIGR4 (Brückner et al., 2004). Uno de ellos contiene dos genes divergentes, spr1403 (pclA) y spr1404 (aquí llamado mgaP). El análisis de la distribución de este clúster entre numerosos aislados clínicos reveló que era un clúster específico de estirpe (Imai et al., 2011; Paterson et al., 2008). Buscando homologías de secuencias aminoacídicas, encontramos que MgaP tiene similitud (60.3%) con el regulador MgaSpn, el cual es un miembro de la familia Mga/AtxA que está presente en TIGR4 y R6 (Hemsley et al., 2003; Solano-Collado et al., 2012). En esta Tesis, hemos trabajado en los siguientes objetivos: (a) Analizar la expresión del gen mgaP en S. pneumoniae R6, (b) Estudiar el efecto de MgaP sobre la transcripción del gen pclA (proteína de tipo colágeno), y (c) Analizar si las proteínas MgaP y MgaSpn tienen características comunes en su interacción con el ADN. Resultados y Conclusiones Mediante qRT-PCR, hemos observado que el gen mgaP se transcribe en condiciones de laboratorio. Comparado con la fase estacionaria, la transcripción de mgaP es mayor en la fase logarítmica del crecimiento bacteriano. Además, por primer extension y fusiones transcripcionales,

hemos mostrado que la transcripción de mgaP comienza en el promotor PmgaP, el cual no parece estar auto-regulado. Hemos demostrado que MgaP es un activador transcripcional. Utilizando estirpes de neumococo que sintetizan diferentes niveles de MgaP, hemos observado que MgaP incrementa los niveles de transcripción del gen pclA (qRT-PCR), así como la actividad del promotor PpclA (fusiones transcripcionales). Esta activación requiere la presencia de una región localizada aguas arriba del promotor PpclA (posiciones -76 a -106). Además, mediante footprinting con DNasa I y usando una versión de MgaP con cola de histidinas (MgaP-His), hemos demostrado que MgaP reconoce un sitio específico aguas arriba del promotor PpclA (posiciones -68 a -169). Estudios previos de nuestro laboratorio mostraron que MgaSpn activa al promotor P1623B uniéndose a un sitio específico aguas arriba del promotor (posiciones -60 a -99) (Solano- Collado et al., 2013). En este trabajo, por análisis in silico, hemos encontrado que MgaP y MgaSpn presentan una idéntica organización de dominios funcionales. También, mediante ensayos de retraso en gel, hemos visto que MgaP, al igual que MgaSpn, puede interaccionar con fragmentos de ADN lineal sin reconocer una secuencia nucleotídica específica y generar complejos multiméricos. No obstante, mediante experimentos de footprinting con DNasa I, hemos demostrado que estas proteínas presentan diferentes especificidades de unión a ADN: MgaP no reconoce el sitio de unión de MgaSpn y viceversa.