Directed evolution of unspecific peroxygenase: synthesis of human drug metabolites and design of functional fusion enzymes

Abstract

[EN] Discovery and testing of new bioactive compounds are becoming emergent fields in contemporary chemistry. All metabolites formed above 10% of the parent drug should be tested in terms of safety; therefore it is fundamental to produce high amounts of them. Unspecific peroxygenases (UPOs, EC 1.11.2.1) are stable and extracellular heme-thiolate enzymes considered by many as the generational relief of P450s, acting on drugs as “extracellular livers”. These enzymes have been studied before for the synthesis of human drug metabolites (HDMs) presenting a wide range of substrate conversion. Several UPO mutant libraries were constructed and screened in search for improved peroxygenase activity and diminished peroxidase activity during this given biotransformation. The final mutant, SoLo, carried one single mutation (F191S) and showed a catalytic efficiency for the conversion of propranolol enhanced by two orders of magnitude together with 99% regioselectivity in the synthesis of the true HDM 5´-hydroxypropranolol (5´-OHP). This mutant together with other evolved AaeUPO variants were further tested with other drugs, unveiling the importance of the amino acids lining the heme channel. Additionally, UPO fusion enzymes were designed by linking the evolved UPO to aryl-alcohol oxidase (AAO, EC 1.1.3.7). After testing several orientations, signal sequences and peptide linkers, five constructions of UPO_AAO were functionally expressed in yeast and characterized biochemically. The best fusion was tested achieving 62,145 TTNs for HDM dextrorphan synthesis. This fusion represents a self-sufficient system to produce HDMs in a preparative manner from newly discovered drugs as well as to be applied in cascade reactions where both AAO and UPO partners could interact.

[ES] El descubrimiento y evaluación de nuevos compuestos bioactivos constituye un campo emergente dentro de la química contemporánea. Todos los metabolitos formados a partir de un fármaco en una proporción superior al 10% deben ser evaluados en términos de seguridad, por lo que su producción para tales estudios se considera prioritaria. Sin embargo, su síntesis química se encuentra generalmente asociada con bajos rendimientos y procesos muy complejos, por lo que están surgiendo nuevos procesos enzimáticos como potencial solución. En este sentido, las peroxigenasas inespecíficas (UPOs, EC 1.11.2.1) son enzimas hemotioladas estables y extracelulares que son consideradas por muchos como el relevo generacional de las citocromo P450 monooxigenasas, pudiendo actuar sobre los fármacos como “hígados extracelulares”. Estas enzimas han sido estudiadas con anterioridad para la síntesis de metabolitos humanos de fármacos (HDMs), presentando una gran diversidad en cuanto a conversión de sustrato. En la presente Tesis Doctoral, se ha estudiado la ingeniería de la UPO de Agrocybe aegerita (AaeUPO) i) para la producción eficiente de HDMs del beta-bloqueante propranolol, ii) para la exploración de variantes enzimáticas para futuros estudios de síntesis de HDMs, y iii) para la creación de un sistema autosuficiente para este propósito basado en la tecnología de proteínas de fusión. Para lograr la producción eficiente de HDMs de propranolol, se llevó a cabo evolución dirigida guiada por la estructura de la proteína, conjugando un sistema de expresión en Saccharomyces cerevisiae junto con un robusto método de cribado de alto rendimiento. Se construyeron y evaluaron diversas genotecas buscando un incremento en la actividad peroxigenasa y una disminución en la actividad peroxidasa para esta transformación en particular. El mutante final, SoLo, presentó una única mutación (F191S) y mostró una eficiencia catalítica para la conversión del propranolol aumentada en dos órdenes de magnitud junto con una regioselectividad del 99% en la producción del HDM 5´-hidroxipropranolol (5´-OHP). Con el fin de aumentar el rendimiento del sistema, se realizaron experimentos de ingeniería de la reacción acoplando el mutante a un sistema de generación de H2O2 in situ que hacía uso metanol como donador de electrones, alcanzando unos números de recambio totales (TTN) de 264,000. Este mutante, junto con otras variantes evolucionadas de AaeUPO fueron evaluadas con dextrometorfano, tolbutamida y naproxeno, desvelando la importancia que tienen los aminoácidos que tapizan el interior del canal del hemo. Futuros esfuerzos centrados en esta región podrían permitir expandir la promiscuidad de sustrato de la UPO. Debido a los buenos resultados obtenidos al combinar la ingeniería de la enzima y el de la reacción para la producción de HDMs, se diseñaron enzimas de fusión uniendo la UPO evolucionada a una aril-alcohol oxidasa (AAO, EC 1.1.3.7), una flavoenzima fúngica que proporciona H2O2 al consorcio ligninolítico durante la degradación natural de la madera. Tras probar diferentes orientaciones, péptidos señales y linkers, se expresaron funcionalmente en levadura 5 construcciones de UPO_AAO que fueron caracterizadas bioquímicamente. La fusión H fue evaluada con dextrometorfano y alcohol 4-fluorobencílico como sustratos, alcanzando unos TTN de 62,145 para la síntesis de dextrorfano. Esta fusión representa un sistema autosuficiente para la producción preparativa de HDMs de nuevos fármacos, así como para la aplicación en reacciones en cascada en las que tanto la AAO como la UPO puedan interaccionar.