Caracterización de una feruloil esterasa de Lactobacillus fermentum

Abstract

[Introducción]: Las feruloil esterasas (FE) son enzimas responsables de la liberación de ácidos hidroxicinámicos (AH), tales como el ácido ferúlico, cafeico, p-cumárico y sinápico, a partir de sus formas esterificadas no biodisponibles presentes en la pared celular de cereales, frutas y verduras. Estos ácidos son compuestos fenólicos con demostrada actividad antioxidante. Numerosos estudios relacionan el consumo de alimentos ricos en AH con una menor incidencia de enfermedades asociadas a desequilibrios en el estado oxidativo del organismo, como diabetes tipo 2, obesidad, síndrome metabólico, entre otras. Las FE son producidas por distintos géneros bacterianos presentes en el intestino humano y animal y se han descrito en algunas cepas aisladas de alimentos, principalmente lactobacilos. No obstante, existe muy poca información sobre FE de L. fermentum. Estudios previos evidenciaron que la administración de L. fermentum CRL1446, cepa probiótica con actividad FE, mejora el estado oxidativo y metabólico de ratones sometidos a diferentes dietas de malnutrición. Dado que las FE jugarían un rol fundamental en el efecto beneficioso sobre la salud del huésped, resulta de interés caracterizar las mismas. [Objetivo]: Caracterizar la enzima responsable de la actividad FE en L. fermentum CRL1446. [Métodos]: Se amplificó por PCR el gen que codifica una posible enzima con actividad FE (GenBank PNV58462.1) y se clonó en el vector pURI3-Cter. La proteína recombinante se hiperprodujo en Escherichia coli BL21 (DE3) empleando isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) como inductor de la expresión del gen y se purificó por cromatografía de afinidad. Su pureza se determinó por electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). La especificidad de sustrato se determinó mediante un método espectrofotométrico frente a sustratos cromogénicos (p-nitrofenil-ésteres de ácidos grasos de C2 a C16). El perfil de sustratos sobre los cuales actúa la enzima fue evaluado usando una librería de 43 ésteres comerciales. El efecto de temperatura, pH y distintos aditivos (iones metálicos, surfactantes, inhibidores, agentes reductores, etc.) sobre la actividad esterasa se determinó empleando p-nitrofenil butirato (pNP-C4). [Resultados]: Se logró hiperproducir una proteína de masa molecular aproximada de 27 KDa. La misma presentó mayor especificidad de sustrato frente a pNP-C4. De los 43 ésteres ensayados en la librería, la enzima presentó una mayor actividad hidrolítica sobre acetato de propilo e hidrolizó eficazmente los sustratos modelo de actividad FE (cafeato, sinapato, ferulato y p-cumarato de metilo), evidenciando que es una FE. La enzima presentó actividad óptima entre 30-40°C, mostrando a 55°C una actividad residual del 83%. Fue activa en el rango de pH de 5 a 8, presentando máximo de actividad a pH 6-7. La actividad fue inhibida en presencia de algunos aditivos, mientras que ninguno actuó como activador. [Conclusión]: Se logró caracterizar bioquímicamente la feruloil esterasa de L. fermentum CRL1446, lo que permitirá proyectar nuevas aplicaciones biotecnológicas de la misma.