Evaluación de la resistencia a la tinta de plantas transgénicas de Castanea sativa con sobreexpresión del gen CsTL1 que codifica una taumatina

Abstract

El castaño (Castanea sativa) es una especie forestal de gran valor económico y cultural que ha sufrido el ataque devastador de varias enfermedades fúngicas causadas por Phytophthora cinnamomi y P. cambivora (tinta), y Cryphonectria parasitica (chancro). Aunque el mecanismo exacto de acción de genes que codifican para proteínas del tipo taumatina se desconoce, en algunas especies en las que se han obtenido plantas transgénicas que expresan estos genes, éstas exhiben mejores niveles de resistencia a hongos patógenos o retraso en el desarrollo de síntomas en comparación con las plantas control. En este trabajo se abordan los siguientes objetivos:1) transformación genética del castaño con el gen CsTL1 (aislado en castaño) y que codifica una taumatina y 2) evaluación del nivel de resistencia a la tinta de las plantas transgénicas obtenidas. Embriones somáticos de castaño de tres líneas embriogénicas (CI-3, CI-9 y C12-H12) se cocultivaron con la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens que está transformada con el vector pK7WG2D-TAU. Además del gen CsTL1, el vector contiene el gen de la neomicina fosfotransferasa (NPTII) y el gen de la proteína verde fluorescente (GFP). Se obtuvieron un total de 126 líneas transformadas, de las cuales 18 corresponden al genotipo CI-3, 27 al genotipo C12-H1 y 81 al genotipo CI-9. La presencia y expresión del gen de la taumatina en las diferentes líneas que resultaron GFP positivas se determinó mediante PCR, Southern blot y qRT-PCR. En base a los resultados de la qRT-PCR se han seleccionado tres líneas transgénicas que presentaban un incremento de 2 a 4 veces del nivel de expresión del gen de la taumatina. Tras las etapas de germinación de los embriones somáticos y de proliferación y enraizamiento de los brotes, éstos se transfieren a un medio WPM líquido con puente de papel inoculado con zoosporas de P. cinnamomi para los ensayos de resistencia in vitro (Cuenca et al. 2009). El grado de resistencia o susceptibilidad a la enfermedad se determinó en función del tiempo transcurrido para producir el 100% de la mortalidad en plantas transgénicas, en plantas no transformadas, en plantas de C. sativa (control susceptible externo) y en plantas de C. crenata (control resistente). Los primeros ensayos indican que existe una correlación entre los niveles de expresión y el tiempo de supervivencia, observándose que las líneas CI-3-TAU3 y CI-3-TAU4 que presentan unos mayores niveles de resistencia a la tinta son las que muestran unos mayores niveles de expresión.