Conservación de germoplasma de especies leñosas con técnicas de cultivo in vitro y almacenamiento en frío

Abstract

La producción de madera, productos forestales no maderables, biocombustibles, la protección del suelo o la restauración del paisaje, unido a un interés creciente por la protección y conservación de los ecosistemas, denotan la importancia de las especies forestales en todo el mundo. Los sistemas tradicionales de conservación ex-situ (ej. bancos de semillas y colecciones en campo) han contribuido de forma fundamental a la preservación de los recursos vegetales. Sin embargo, numerosas Angiospermas forestales (ej. castaño, roble, castaño de indias y muchas especies tropicales) tienen semillas recalcitrantes que pierden rápidamente la viabilidad o su capacidad de germinación se reduce considerablemente durante su almacenamiento. Las técnicas de cultivo in vitro han contribuido, desde su inicio, de forma muy importante no sólo a la propagación de estas especies sino también a su conservación. Actualmente, se utilizan de forma sistemática en la conservación e intercambio de recursos fitogenéticos, siendo especialmente necesarias para preservar el germoplasma de los individuos obtenidos mediante transformación genética. Para la conservación in vitro de material vegetal existen tres opciones diferentes: 1) subcultivos secuenciales in vitro sin restricción del crecimiento, 2) imponiendo un crecimiento reducido (almacenamiento a medio plazo) y 3) suprimiendo totalmente el crecimiento mediante temperaturas ultrabajas o crioconservación (almacenamiento a largo plazo). Desde hace 30 años en el Departamento de Fisiología Vegetal del Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia (IIAG) se ha obtenido la regeneración in vitro de numerosas especies leñosas, basándose fundamentalmente en el sistema organogénico vía multiplicación de yemas axilares y en el sistema de inducción de embriogénesis somática. El objetivo del presente trabajo es mostrar algunos de los principales resultados sobre los estudios realizados en el IIAG sobre la conservación de diferentes especies leñosas mediante cultivo in vitro y el almacenamiento en frío de las mismas.

El material vegetal empleado para realizar los experimentos de crecimiento reducido mediante el almacenamiento en frío fueron explantos nodales y ápices caulinares (1-1,5 cm) aislados de cultivos de brotes mantenidos in vitro mediante la multiplicación de yemas axilares de diferentes especies de los siguientes géneros: Castanea (C. sativa y Castanea sativa x C. crenata), Quercus (Q. robur, Q. bicolor, Q. rubra, Q. petraea. y Q. alba), Populus (P. alba y Populus tremula x P. tremuloides), Fagus (F. sylvatica y F. orientalis), Betula pendula, Ulmus (U. minor y U. glabra), Prunus (P. avium y P. serrulata), Camellia (C. japonica y C. reticulata), y Malus sp.. Para su conservación se han utilizado armarios frigoríficos (340 L Sanyo Medicool MPR 311D) que proporcionan 2-4ºC de temperatura y como única fuente de luz se ha empleado la iluminación exterior “dim light” (8-10 mmol.m-2 s-1). En estos experimentos, se han estudiado factores como el tipo de explanto, tiempo de pre-almacenamiento y duración del almacenamiento en frío.

Como parte de las estrategias para disminuir el crecimiento de los explantos destaca, desde un punto de vista práctico, la reducción de la temperatura y/o iluminación durante el almacenamiento, por su eficacia y simplicidad. Por ese motivo, las condiciones de luz y temperatura para conseguir un almacenamiento eficaz fueron los primeros factores a determinar. Los rangos de temperaturas para cultivos de especies leñosas oscilan entre -3ºC a +12ºC, aunque la mayoría de las especies se almacenan entre 2ºC y 5ºC. En nuestro caso, la temperatura utilizada para todas las especies estudiadas fue de 2- 4ºC. Durante el almacenamiento los cultivos pueden mantenerse en condiciones de luz o de oscuridad dependiendo de la especie. En nuestro trabajo, se ha utilizado una intensidad lumínica muy baja para todas las especies excepto en el castaño y el álamo que se mantienen en oscuridad. Uno de los factores que más influyen en la supervivencia del material almacenado es el tiempo transcurrido desde el último subcultivo en condiciones estándar hasta su almacenamiento en frío. En los cultivos de roble, castaño, manzano y cerezo forestal se ha determinado que 10-12 días de subcultivo previo son necesarios para obtener un almacenamiento óptimo; este período se extiende a dos semanas en el caso del álamo, abedul y haya y a cuatro semanas en la camelia. Bajo estas condiciones es posible mantener el material vegetal de todas estas especies durante al menos un año sin que sea necesario su transferencia a medio fresco. En el caso del haya, álamo, la camelia, el abedul y algunos genotipos de castaño el periodo de almacenamiento puede extenderse a 18 meses o incluso más. Una vez optimizados los tiempos de subcultivo previo y de almacenamiento en frío, los porcentajes de supervivencia obtenidos, después de ser transferidos a condiciones de crecimiento estándar, son del 85 al 100% en estas especies, recuperando los cultivos sus tasas de multiplicación normales después de 1-2 subcultivos sucesivos. De todas las especies evaluadas, el material de castaño y el de roble es el más afectado por el almacenamiento a bajas temperaturas. El manzano, la camelia, el abedul, el cerezo forestal y el haya no se deterioran tanto por el frío mostrando crecimiento incluso durante su almacenamiento, si bien con síntomas de etiolación y clorosis. La conservación en frío también se ha aplicado para mantener líneas transgénicas de álamo y castaño obtenidas en nuestro laboratorio. En el caso del álamo se encuentran almacenadas en frío unas 200 líneas portadoras de genes que inhiben la formación de polen, genes que confieren resistencia a TNT y genes que incrementan la tolerancia a metales pesados, observándose un porcentaje de supervivencia del 100% después de al menos un año de conservación en frío. En castaño, se mantienen en frío 4 líneas transformadas con genes marcadores, que muestran un 100% de supervivencia después de 6 meses de almacenamiento.

En nuestro Departamento se han definido las condiciones para el desarrollo y mantenimiento a medio plazo de un banco de germoplasma in vitro de especies leñosas constituido en la actualidad por 21 especies que se conservan mediante cultivo in vitro y/o almacenamiento a baja temperatura.