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Title

Liberación de péptidos multifuncionales durante la digestión gastrointestinal simulada de proteínas de quinua (Chenopodium quinua Willd) y amaranto (Amaranthus Caudatus)

AuthorsVilcacundo, Rubén
AdvisorCarrillo, W. ; Hernández-Ledesma, Blanca
Issue Date2017
PublisherCSIC-UAM - Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL)
AbstractEn la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el estudio de la quinua (Chenopodium quinoa Willd.) y amaranto (Amaranthus caudatus) como fuentes de péptidos biactivos. Por un lado, se han estudiado las modificaciones que sufren las proteínas alimentarias durante la digestión gastrointestinal y, por otro, se han evaluado diferentes actividades biológicas, identificando los péptidos potencialmente responsables de dichas actividades. Inicialmente, se llevó a cabo la optimización del proceso de extracción de los concentrados proteicos de quinua y amaranto evaluando el efecto, tanto del pH de solubilización como el de precipitación de las proteínas, sobre el rendimiento del proceso y la concentración de proteína obtenida. En el caso del concentrado de proteína de quinua, el mayor rendimiento (6,3%) se obtuvo precipitando a pH 4,0 las proteínas presentes en la harina desengrasada obtenida a partir de este pseudocereal. Tras el análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE-nativa) y con agentes desnaturalizantes (PAGE-SDS) pudieron visualizarse las proteínas mayoritarias contenidas en el concentrado de quinua. La banda con peso molecular de 60 kDa correspondió a la globulina 7S, mientras que las bandas de peso molecular 33-36 kDa y 20-22 kDa correspondieron a las dos subunidades de la globulina 11S. La banda de peso molecular inferior a 15,4 kDa correspondió a las albúminas. En el caso del amaranto, se llevó a cabo la extracción solubilizando las proteínas en condiciones alcalinas a dos pHs (8,0 y 12,0) y precipitando dichas proteínas a diferentes pHs, empleando agua o NaCl como solventes. El mayor rendimiento se obtuvo con la solución salina, aunque la necesidad de llevar a cabo un proceso de diálisis posterior limita el uso de dicha solución como solvente. La caracterización del perfil proteico mediante PAGE-SDS reveló similitud con el perfil de las proteínas de quinua, con una banda de peso molecular 50 kDa, correspondiente a la globulina 7S y varias bandas comprendidas entre 36-38 kDa y 18-20 kDa, que correspondieron a las dos subunidades, ácida y básica, de la globulina 11S. Las albúminas se visualizaron en aquellas bandas con pesos moleculares inferiores a 14,4 kDa. Dado que en los últimos años, las tasas de incidencia y mortalidad de desórdenes crónicos, como el síndrome metabólico, los trastornos cardiovasculares y neurológicos y el cáncer han aumentado de forma notable en nuestra sociedad, se planteó evaluar el papel de las proteínas de quinua y amaranto, tras su digestión gastrointestinal simulada, como fuente de péptidos multifuncionales, centrándose en el estudio de su actividad anti-diabética, antioxidante, anti-hipertensiva y citotóxica frente a células de cáncer de colon. Los concentrados proteicos de ambos pseudocereales fueron sometidos a un proceso de digestión gastrointestinal simulando las condiciones fisiológicas, con incubación secuencial con pepsina y pancreatina. Para ambas especies, la digestión con pepsina hidrolizó de forma parcial las proteínas, que fueron degradadas completamente tras la acción de la pancreatina. Con el objetivo de separar las fracciones peptídicas mayor y menor a 5 kDa, se llevó a cabo la ultrafiltración de los digeridos gástricos y gastroduodenales, evaluando las diferentes actividades biológicas tanto en los digeridos como en sus correspondientes fracciones. La actividad antidiabética in vitro se evaluó midiendo la capacidad de los péptidos para inhibir la enzima dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV), implicada en la degradación de las hormonas incretinas y las enzimas α-amilasa y α-glucosidasa, implicadas en la hidrólisis de carbohidratos. La actividad anti-hipertensiva se evaluó mediante el método in vitro de inhibición de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), involucrada en la regulación de la presión arterial. La actividad antioxidante se determinó mediante dos métodos in vitro, evaluando la capacidad para neutralizar radicales peroxilo (ensayo ORAC) y para inhibir la peroxidación lipídica (ensayo TBARS). Por último, la actividad citotóxica se basó en la capacidad de los péptidos para inhibir la viabilidad de células de cáncer de colon, empleando tres líneas celulares diferentes (Caco-2, HT-29 y HCT116). En el caso de las proteínas de quinua, tanto los digeridos obtenidos durante la fase gástrica como los gastroduodenales presentaron todas las actividades biológicas determinadas, aunque los mayores efectos anti-diabéticos, antioxidantes y citotóxicos se determinaron en el digerido obtenido durante la fase duodenal. Los péptidos de pequeño tamaño fueron responsables de la actividad inhibidora de las enzimas DPP-IV, α-amilasa y α-glucosidasa y de la actividad antioxidante, mientras que los péptidos contenidos en la fracción mayor a 5 kDa fueron los principales responsables de inhibir la viabilidad de las células de cáncer de colon. El digerido gastroduodenal se sometió a un fraccionamiento mediante HPLC a escala semi-preparativa, separándose tres fracciones que mostraron propiedades multifuncionales. El análisis mediante HPLC acoplado a espectrometría de masas en tándem permitió identificar 17 nuevos péptidos liberados a partir de las proteínas de quinua, potencialmente responsables de los efectos beneficiosos para la salud. Destacan las secuencias IQAEGGLT, DKDYPK y GEHGSDGNV, derivadas de la globulina 11S, cuyos efectos anti-diabéticos fueron confirmados. Al igual que las proteínas de quinua, las de amaranto presentaron potencialidad como fuente de péptidos bioactivos tras su digestión gastrointestinal simulada. El digerido gástrico mostró una mayor capacidad de inhibición de la ECA, mientras que los mayores efectos antioxidantes, inhibidores de las enzimas DPP-IV y α-amilasa y de la viabilidad de las células Caco-2 se observaron en el digerido obtenido durante la fase duodenal. En dicho digerido gastroduodenal, el fraccionamiento y posterior análisis mediante HPLC-MS/MS permitió la identificación de 13 nuevos péptidos procedentes de las proteínas secuenciadas de esta especie vegetal, globulina 11S, albúmina 1 y poliamina oxidasa. Entre estos péptidos y tomando como base los estudios existentes en la literatura sobre la relación entre la estructura y las diferentes actividades biológicas pudo concluirse que las secuencias FLISCLL, SVFDEELS y DFIILE podrían ser consideradas como péptidos multifuncionales, ejerciendo actividad antioxidante y capacidad para inhibir la ECA y la α-amilasa. La presencia de estos péptidos y las posibles interacciones entre ellos podría explicar la actividad multifuncional ejercida por los digeridos de las proteínas de amaranto. Recientemente, el modelo de pez cebra (Danio rerio) ha sido empleado de forma exitosa para estudiar la actividad antioxidante de péptidos derivados de proteínas alimentarias. Por lo tanto, se planteó su empleo para evaluar la actividad inhibidora de la peroxidación lipídica de péptidos procedentes de las proteínas de quinua y amaranto tras su digestión gastrointestinal in vitro. Los péptidos liberados durante la fase gástrica presentaron efectos inhibidores de la peroxidación que alcanzaron el 75,2% en el digerido procedente de las proteínas de quinua. La actividad antioxidante aumentó de forma notable tras la hidrólisis con pancreatina hasta valores de inhibición del 82,1% y 77,6% para los digeridos gastroduodenales de proteína de quinua y amaranto, respectivamente. Estos valores fueron comparables al obtenido para el antioxidante sintético butilhidroxitoluol (BHT), usado como control positivo (87,1%). Considerando todos los resultados en conjunto podemos confirmar el importante papel de las proteínas de quinua y amaranto como fuente de péptidos multifuncionales tras su digestión gastrointestinal, de modo que dichas proteínas podrían ser utilizadas como nuevos ingredientes de alimentos funcionales o nutracéuticos, con el fin de reducir las enfermedades asociadas a la diabetes, hipertensión arterial y el estrés oxidativo, incluido el cáncer. Además, los avances obtenidos en esta Tesis Doctoral permiten incrementar el valor nutricional y biológico ya reconocido para estos dos pseudocereales, cuya producción y consumo a nivel mundial se ha incrementado de forma notable en los últimos años.
DescriptionMemoria presentada por Rubén Darío Vilcacundo Chamorro para optar al grado de Doctor en Ciencias de la Alimentación por la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias: Departamento de Química Física Aplicada. Trabajo realizado en el Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL).
URIhttp://hdl.handle.net/10261/196093
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