Generación y caracterización de nuevos modelos celulares asociados al deficit neural en IGF-1

Abstract

La deficiencia humana del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1) causa una enfermedad rara (ORPHA 73272) que cursa con retraso en el crecimiento, microcefalia y sordera neurosensorial. El modelo murino deficiente en Igf1 reproduce el mismo síndrome y presenta una incorrecta diferenciación neuronal del ganglio auditivo acompañada de apoptosis temprana de las neuronas auditivas. El estudio del papel protector que ejerce el IGF-1 frente a la pérdida auditiva es complicado por la heterogeneidad celular de la cóclea y la limitación de los modelos experimentales disponibles. Como consecuencia, se ha generado un modelo celular de la enfermedad humana en la línea de neuroblastoma murino Neuro2a mediante edición génica con CRISPR/Cas9. Dicho modelo reproduce la deleción parcial del exón 3 del gen Igf1 murino descrita como causante de pérdida auditiva en el hombre. Para la edición génica se transfectó el complejo crRNA:tracrRNA:Cas9 en forma de ribonucleoproteína y se comprobó su incorporación en las células mediante microscopía detectando el tracrRNA marcado fluorescentemente. La presencia de mutaciones se evaluó mediante Surveyor y se seleccionaron las células mutadas tras clonación por dilución límite. La edición del gen Igf1 se comprobó por PCR en 56 clones y 5 de ellos se secuenciaron mediante el méetodo Sanger, confirmándose la deleción parcial de Igf1 en dos de los clones. Para el resto se emplearía la herramienta Mosaic Finder, desarrollada in-house, que permite analizar la multiplicidad alélica generada tras la edición genética mediante next-generation sequencing (NGS) y posterior análisis bioinformático. Finalmente, se ha iniciado un estudio del estado neuroinflamatorio de los clones secuenciados y de su respuesta a distintos estímulos pro-inflamatorios, que puede contribuir a desvelar algunos mecanismos moleculares asociados a la deficiencia crónica de IGF-1.