Caracterización de proteína-fosfatasas de tipo 1 de Leishmania infantum y estudio mediante RNA-Seq de las alteraciones en la expresión génica diferencial inducidas en líneas knock-in

Abstract

[EN]Leishmania infantum (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) is the causative agent of visceral leishmaniasis in the Mediterranean Basin, where dogs are the main reservoir. The infection is transmitted to the mammalian host by the bite of dipteran of the subfamily Phlebotominae. The life cycle of the parasite is digenetic and two stages alternate: the motile promastigote stage which develops in the invertebrate host and the non-motile amastigote stage, which multiplies within phagocytes of the mammalian host. Genome sequencing of the main Leishmania species was published between 2005 and 2007, and the development of high-throughput techniques, such as DNA microarrays, quantitative proteomics, and more recent methods based on next generation sequencing, have made exhaustive analysis of gene expression profiles of the parasite possible throughout the life cycle. This has been performed in order to find possible virulence factors involved in pathogenicity and/or possible therapeutic targets and vaccine candidates. In a previous comparative transcriptomics analysis performed in the laboratory of Molecular Parasitology of the Biological Research Center (CSIC), differential expression of the genes LinJ.34.0840 and LinJ.15.0240 encoding protein phosphatases 1 (PP1) was described in promastigotes isolated from the vector Phlebotomus perniciosus. Even though it has become clear that the phosphorylation status of protein is remarkable during the differentiation processes of the parasite, funcionality of PP1 proteins from Leishmania spp. is not known accurately so far, as well as the signalling pathways in general. For this reason, characterization of these proteins was proposed to develop this doctoral thesis, which has been carried out in the laboratory mentioned. Approximately one third of proteins of eukaryotic organisms are regulated by phosphorylation. Protein phosphatases are the enzymes responsible for eliminating phosphate esters from these proteins. According to their substrate specificity, protein phosphatases can be classified in two sub-groups: tyrosine phosphatases (PTP) and serine/threonine phosphatases (STP). PP1s are STP and constitute the most important family of protein phosphatases in terms of substrate diversity. Each PP1 holoenzyme is composed by a catalytic subunit and a regulatory subunit. The PP1 catalytic subunit is one of the most conserved proteins among eukaryotic organisms and has an approximate sequence identity of 70% and a molecular size comprised between 35 and 38 kDa. PP1s act in a very specific and strictly regulated mode due to their ability to form complexes with a great number of subunits that control their location, activity and substrate specificity. About 200 PP1 regulatory subunits or interaction proteins have been identified in vertebrate organisms. This explains the diversity of functions in which PP1 are involved: transcription, cell cycle, translation, metabolism, organization of the cytoskeleton, regulation of transporters, etc.The main objective of this doctoral thesis is characterization of the PP1 encoded by the gene LinJ.15.0240 (PP1-240) and the PP1 cluster located on chromosome 34 (LinJ.34.0820, LinJ.34.0830, LinJ.34.0840 and LinJ.34.0850) of L. infantum (cluster PP1-34). Said characterization includes the analysis of the primary structure, the analysis of gene expression in the main stages of the life cycle of the parasite, the study of the sub cellular localization and the study of the global alterations of differential gene expression in knock in axenic promastigote lines. In other words, stable transfectants that constitutively over-express PP1-240 or cluster PP1-34

The multiple alignments performed have revealed a sequence similarity of 45% for protein PP1-240 and 60% for the consensus sequence of cluster PP1-34 with respect to nine PP1 encoded by different organisms representative of the main taxa of the evolutionary scale, with a similar level of identity to the ortholog in the genus Trypanosoma (~55%). PP1s of trypanosomatids are among the most divergent of the eukaryotic organisms analyzed. All four PP1 defined as cluster PP1-34 contain a highly conserved (>95%) common catalytic core, and a variable N-terminus. This evidence has been observed also between mammalian PP1s, and isoforms have been described: PP1α, PP1β, PP1ϒ1 y PP1ϒ2. For this reason, all four PP1s integrated in the cluster PP1-34 of L. infantum may correspond to different isoforms derived from the same protein, as in the case of mammals.The protein PP1-240 and the cluster PP1-34 maintain all amino acids involved in interaction with substracts and metal ions intact. These data confirm that the PP1 sequences of L. infantum are evolutionary conserved.This study has confirmed in vitro STP activity of the fusion protein PP1-840-MBP obtained under native conditions by using the heterologous expression system composed by the plasmid vector pETM-41 and the SHuffle E. coli strain. This system that allows fusing the sequence of interest to the MBP was used because PP1s of L. infantum are insoluble, like orthologs such as human PP1s.The studies performed by quantitative RT-PCR (qRT-PCR) and Western blot have allowed to determine the relative gene expression levels of PP1-240 and cluster PP1-34 throughout the growth curve of axenically cultured promastigotes. Relative abundance of protein PP1-240 is analogous at this stage, according to what has been observed by means of Western blot. This finding supports that expression of PP1-240 is constitutive in axenically cultured promastigotes. In the case of cluster PP1-34, a light increase of the protein abundance has been detected at the stationary phase of axenic culture of promastigotes according to Western blot assays. For this reason, a post-transcriptional regulatory mechanism controlling expression of this protein may exist. qRT-PCR studies have been also carried out to evaluate the steady-state transcript levels of PP1-240 and cluster PP1-34 in the populations of metacyclic promastigotes, both derived from the gut of the sand fly vector P. perniciosus (Pro-Pper) or from the non-agglutinating subpopulation with peanut lectin within the stationary phase population in -axenic culture (PNA ), and also amastigotes, compared to axenic promastigotes in logarithmic and stationary phase. The gene expression fold changes were lower than 2 in all cases with variation, although these differences were statistically significant. The most relevant ones consist of up-regulation of genes LinJ.15.0240, LinJ.34.0820 and LinJ.0850 in -Pro-Pper vs. PNA . These data reveal the influence of the culture conditions in the gene expression profiles of L. infantum. Protein PP1-240 is more abundant in intracellular amastigotes obtained from in vitro infections of the U937 cell line, with respect to axenic amastigotes, according to the Western blot assays. These assays are not viable in the case of Pro-Pper currently because of the reduced amount of biological material from the parasite that can be obtained from the gut of the vector.

The indirect immunofluorescence assays (IFA) have confirmed the expression profile observed by means of Western blot for protein PP1-240 and the proteins from the cluster PP1-34 in the life cycle of L. infantum. Therefore, protein PP1-240 has been detected by both methods in both promastigotes and amastigotes, whereas the cluster PP1-34 was only detected in promastigotes. Protein PP1-240 is distributed in the whole extension of the flagellar appendix and the flagellar pocket, while PP1 encoded by cluster PP1-34 are localized mainly in the flagellar pocket. This area has an essential role in morphogenesis of trypanosomatids and is involved in endocytosis and exocytosis. Likewise, correct formation of the flagellar pocket is crucial for viability and infectivity of the parasite. Therefore, sub cellular location observed in the case of protein PP1-240 and the proteins from cluster PP1-34 may present a key role in infectivity and cellular differentiation processes which take place during the life cycle of Leishmania. With the aim of obtaining information about the biological functionality of PP1s of L. infantum, three knock-in promastigote lines were generated using the pIR integrative plasmid vector. Global gene expression of these knock-in cell lines was analyzed by RNA-Seq at days 1, 3 and 5 of the growth curve. In the case of PP1-240, two knock-in cell lines were generated, pIR-PP1-240 and pIR-PP1-240T, with the aim of constitutively over-expressing the whole PP1-240 sequence and a truncated version lacking the N-terminus (PP1-240T), respectively. In the case of cluster PP1-34, the knock-in pIR-PP1C-34 cell line was generated for over-expression of the common catalytic region encoded by this cluster. RNA-Seq analysis of lines pIR-PP1-240 and pIR-PP1-240T have revealed differential expression of 103 and 92 genes, respectively. In both lines, more than 80% of changes in relative expression were detected during the first day of the growth curve. These results are correlated to the high mRNA and protein levels described previously for pIR-PP1-240 and pIR-PP1-240T transfectants at day 1. In both cases, RNA-Seq analysis revealed over-expression of the respective proteins at days 1, 3 and 5 of the growth curve. However, this up-regulation was higher at day 1, namely 4 and 2,5 times, respectively. In addition, the global changes consist of down-regulation in more than 85% cases. According to the Gene Ontology (GO) functional nomenclature and enrichment analysis in GO functions, those genes differentially expressed in both pIR-PP1-240 and pIR-PP1-240T are related basically with the following biological processes: gene expression, translation, transport of molecules, and metabolic activities. However, certain metabolic processes observed in pIR-PP1-240, such as those related with pteridin, were not detected in pIR-PP1-240T, whereas terms describing other processes related with riboflavin or transport of metal ions were found in the pIR-PP1-240T transfectant.

Clustering analysis performed on the basis of the euclidean distance by means of the War hierarchical method using edgeR v.3.12.1 software on the set of RNA-Seq data has revealed that the expression profiles of lines pIR-PP1-240 and pIR-PP1-240T are similar at day 1. Namely, the study of the sets of down-regulated genes at day 1 yields a total of 48 common genes between both lines, including genes of known function and hypothetical proteins. In fact, this intersection between both sets represents more than one half of the total number of differentially expressed genes in both lines. Therefore, the expression profiles detected in pIR-PP1-240 and pIR-PP1-240T indicate that the protein PP1-240 maintains certain activity despite deletion of the N-terminus. Likewise, the results suggest that the N-terminus of protein PP1-240 may have a relevant function in the interaction with certain regulatory proteins, whereas said interaction may occur through the surface of the catalytic subunit PP1-240 in the case of other proteins, as it has been described in the majority of PP1s. The study of the cell line pIR-PP1C-34 by means of RNA-Seq has revealed differential expression of 279 at days 1, 3 and 5 of the growth curve. Approximately 95% of differentially expressed genes are uniformly distributed between days 1 and 3 of the growth curve. However, these results are not correlated with the fold-change found for PP1C-34, where a progressive decrease of the over-expression levels were detected throughout the growth curve. The detailed study of differentially expressed genes in pIR-PP1C-34 has revealed down-regulation of a considerable number of genes which has been previously detected in transfectants pIR-PP1-240 and pIR-PP1-240T.

According to the gene ontology studies including functional enrichment analysis, the genes over-expressed in pIR-PP1C-34 at days 1 and 3 show biological functions related to gene expression regulation, translation, macromolecule biosynthetic processes and protein folding. These processes are essentially linked to the cell components of the nucleus, ribosomes and mitochondria. These results show an expression profile similar to those of transfectants pIR-PP1-240 and pIR-PP1-240T. In previous phosphoproteomics assays, variations of the phosphorylation profiles were detected during the differentiation process of promastigotes. These changes are related to post-translational modifications, mainly with the cellular functions of initiation of translation, protein folding and protein catabolism. However, up-regulation of certain genes related with the basal body and dynein complexes is remarkable in the case of pIR-PP1C-34. The dynein complexes are related to protein phosphorylation, movement associated to microtubules and cytokinesis. This expression profile has been detected exclusively in the pIR-PP1C-34 transfectant and has been also observed in mammalian cells, where PP1 activity is associated with cytoskeleton organization. The comparative study of the gene expression profiles of all three knock in lines have revealed that up-regulation of the corresponding PP1s of interest has triggered down-regulation of 45 common genes, of which 16 are genes of known function. This fact may be due to the interaction mechanisms of the PP1s that has been described with PIP, where this association is carried out through the protein surface of the conserved catalytic region of the PP1s. In summary, the studies performed in this doctoral thesis have revealed the following: i) the high sequence conservation degree of the L. infantum protein-phosphatases PP1-240 and cluster PP1-34; ii) the global expression profile changes in the generated over-expression transfectants induce a down-regulation in more than 85% of genes; iii) studied PP1 are related with the cellular process of transcription, translation, post-translational modifications, cell cycle, transport and surface proteins; iv) PP1-240 is probably associated with cell differentiation processes in L. infantum as suggests the sub-expression of SHERP and META1 genes in the knock-in promastigote line pIR-PP1-240; v) the PP1-34 cluster is involved in cellular processes related to the cytoskeleton and the flagellum.

[ES]Leishmania infantum (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) es el agente causal de la leishmaniosis visceral en la cuenca mediterránea, donde el perro es el reservorio principal. La infección se transmite al hospedador mamífero por la picadura de dípteros de la subfamilia Phlebotominae. El ciclo biológico del parásito es digenético, y en él se alterna un estadío extracelular móvil o promastigote, que se desarrolla en el hospedador invertebrado a su forma intracelular o amastigote, que se multiplica en el interior de fagocitos del hospedador mamífero. La secuenciación de los genomas de las principales especies de Leishmania, publicada entre 2005 y 2007, y el desarrollo de técnicas de alto rendimiento como los microarrays de ADN, la proteómica cuantitativa y más recientemente, las metodologías basadas en la secuenciación masiva, han permitido llevar a cabo un análisis exhaustivo de los perfiles de expresión génica del parásito a lo largo de su ciclo biológico, con el fin de hallar posibles factores de virulencia implicados en su patogenicidad y/o posibles dianas terapéuticas y candidatos vacunales. En un estudio de transcriptómica comparativa llevado a cabo en el laboratorio de Parasitología Molecular del Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC) se describió que los genes LinJ.34.0840 y LinJ.15.0240, que codifican proteína-fosfatasas 1 (PP1), están diferencialmente expresados en promastigotes de L. infantum extraídos directamente del tubo digestivo del vector Phlebotomus perniciosus. Aún habiéndose puesto de manifiesto en diversos estudios la importancia del estado de fosforilación proteico, durante los procesos de diferenciación del parásito, la funcionalidad concreta de las PP1 en Leishmania spp. es desconocida, al igual que las vías de señalización intracelular. Por este motivo, se decidió llevar a cabo la caracterización de estas proteínas en el desarrollo de esta tesis doctoral, realizada en dicho laboratorio. Aproximadamente un tercio de las proteínas de los organismos eucariotas se regulan por fosforilación. Las proteína-fosfatasas son las enzimas responsables de eliminar los ésteres de fosfato de estas proteínas. De acuerdo a su especificidad de sustrato las proteína-fosfatasas se pueden clasificar en dos sub-grupos: tirosina-fosfatasas (PTP) y serina/treonina-fosfatasas (STP). Las PP1 son STP y constituyen la familia más importante de proteína-fosfatasas en términos de diversidad de sustrato. Cada holoenzima de PP1 está compuesta por una subunidad catalítica y una subunidad reguladora. La subunidad catalítica de las PP1 representa una de las proteínas más conservadas en los organismos eucariotas, con una identidad de secuencia aproximada del 70% y un tamaño molecular comprendido entre 35 y 38 kDa. Las PP1 actúan de una manera muy específica y estrictamente regulada, dada su capacidad para formar complejos con un gran número de subunidades que controlan su localización, actividad y especificidad de sustrato.

En los organismos vertebrados se han identificado cerca de 200 subunidades reguladoras o proteínas de interacción con PP1 (PIP). Estos complejos dan lugar a un conjunto diverso de holoenzimas con actividad dirigida a distintos sustratos y mecanismos de regulación propios. Esto explica la diversidad de funciones en las que participan las PP1: transcripción génica, ciclo celular, traducción, metabolismo, organización del citoesqueleto, regulación de transportadores, etc.El objetivo fundamental de esta tesis doctoral es la caracterización de la PP1 codificada por el gen LinJ.15.0240 (PP1-240) y del cluster de PP1 localizado en el cromosoma 34 (LinJ.34.0820, LinJ.34.0830, LinJ.34.0840, LinJ.34.0850) de L. infantum (cluster PP1C-34). Dicha caracterización incluye el estudio de la estructura primaria, el análisis de la expresión génica en los diferentes estadíos del ciclo biológico del parásito, el estudio de la localización subcelular y el estudio de las alteraciones en la expresión génica diferencial en líneas de promastigotes axénicos knock-in, es decir, transfectantes estables que sobre-expresan de forma constitutiva PP1-240 o el cluster PP1-34. Los alineamientos múltiples llevados a cabo han revelado una similitud de secuencia del 45% para la proteína PP1-240 y del 60% para la secuencia consenso del cluster PP1-34 con respecto a nueve PP1 codificadas por diversos organismos representativos de los principales taxones de la escala evolutiva. El nivel de identidad observado es similar al descrito previamente en las PP1 de Trypanosoma (~55%), encontrándose las PP1 de los tripanosomátidos entre las PP1 más divergentes de los organismos eucariotas analizados. Las cuatro PP1 definidas como cluster PP1-34, se caracterizan por la presencia de un núcleo catalítico común altamente conservado (>95%) y un extremo N-terminal variable. Dicha evidencia ha sido observada también entre las PP1 de mamíferos, siendo descritas cuatro isoformas denominadas PP1α, PP1β, PP1ϒ1 y PP1ϒ2. Por ello, las cuatro PP1 integradas en el cluster PP1-34 de L. infantum podrían corresponder a diferentes isoformas derivadas de la misma proteína, al igual que ocurre en mamíferos.

La proteína PP1-240 y el cluster PP1-34 mantienen invariables todos los aminoácidos implicados en la interacción con sustratos e iones metálicos. Estos datos confirman que estas secuencias de PP1 de L. infantum están conservadas evolutivamente. En este estudio, se ha confirmado in vitro la actividad STP de la proteína de fusión PP1-840-MBP obtenida en condiciones nativas a partir del sistema de expresión heteróloga compuesto por el vector pETM-41 y la cepa SHuffle de E. coli. Se empleó este sistema que permite fusionar la secuencia de interés a MBP debido a que las PP1 de L. infantum son insolubles, al igual que ocurre con ortólogos como las PP1 humanas. Los estudios por RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) y Western blot han permitido determinar los niveles de expresión génica relativa de PP1-240 y del cluster PP1-34 a lo largo del ciclo biológico de L. infantum. Según el análisis de los niveles de ARNm mediante qRT-PCR, se ha detectado una tasa de expresión constante de PP1-240 y del cluster PP1-34 a lo largo de la curva de crecimiento en promastigotes en cultivo axénico. La abundancia relativa de la proteína PP1-240 es análoga en este estadío, según se ha observado mediante Western blot, lo que indica que la expresión de PP1-240 es constitutiva en promastigotes en cultivo axénico. En el caso del cluster PP1-34 se ha detectado un ligero aumento de la abundancia de proteína en promastigotes axénicos en fase estacionaria según los estudios de Western blot, por lo que podría existir un mecanismo de regulación génica a nivel post-transcripcional que controle la expresión de estas proteínas.También se han realizado estudios para evaluar por qRT-PCR los niveles de tránscrito de PP1-240 y del cluster PP1-34 en poblaciones de promastigotes metacíclicos (tanto derivados del tubo digestivo del vector Phlebotomus perniciosus, o Pro-Pper, como derivados de cultivo axénico no aglutinantes con lectina de cacahuete, o PNA ) y amastigotes con respecto a promastigotes en cultivo axénico en fase logarítmica y estacionaria. Las tasas de variación de la expresión génica o fold change fueron inferiores a 2 en todos los casos en las que se detectaron, si bien dichas diferencias eran estadísticamente significativas. Las más relevantes consisten en la sobre-expresión de los genes LinJ.15.0240, LinJ.34.0820 y LinJ.34.0850 en Pro-Pper vs. PNA . Estos datos ponen de manifiesto la influencia de las condiciones de cultivo en los perfiles de expresión génica de L. infantum. La proteína PP1-240 es más abundante en amastigotes intracelulares obtenidos a partir de infecciones in vitro de células U937 con respecto a amastigotes axénicos, según han puesto de manifiesto los ensayos de Western blot. Estos ensayos no son viables en el caso de Pro-Pper actualmente, debido a la reducida cantidad de material biológico del parásito que es posible obtener a partir del tubo digestivo del vector.

Los ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFI) han confirmado el perfil de expresión observado mediante Western blot para la proteína PP1-240 y el cluster PP1-34 en el ciclo biológico de L. infantum. Así, la proteína PP1-240 ha sido detectada por ambos métodos tanto en promastigotes como en amastigotes, mientras que el cluster PP1-34 sólo se detectó en promastigote. La proteína PP1-240 se distribuye en toda la extensión del apéndice flagelar y el bolsillo flagelar, mientras que las PP1 codificadas por el cluster PP1-34 se disponen principalmente en el bolsillo flagelar. Este área tiene un papel fundamental en la morfogénesis de los tripanosomátidos y está implicada en la endocitosis y la exocitosis. Asimismo, la correcta formación del bolsillo flagelar es crucial para la viabilidad y la infectividad del parásito. Por tanto, la localización subcelular observada de la proteína PP1-240 y de las proteínas del cluster PP1-34 podrían presentar un papel clave en la infectividad y los procesos de diferenciación celular que tienen lugar durante el ciclo biológico de Leishmania. Con el fin de obtener información acerca de la funcionalidad biológica de las PP1 de L. infantum, se generaron líneas de promastigotes knock-in utilizando el vector plasmídico integrativo pIR, cuya expresión génica global fue analizada mediante RNA-Seq en los días 1, 3 y 5 de la curva de crecimiento. En el caso de PP1-240, se generaron dos líneas knock-in: pIR-PP1-240 y pIR-PP1-240T, para la sobre-expresión constitutiva de PP1-240 en su versión completa y sin el extremo N-terminal (PP1-240T), respectivamente. En el caso del cluster PP1-34, se generó la línea celular knock-in pIR-PP1C-34 que sobre-expresa la región catalítica común codificada por el cluster mencionado. El análisis por RNA-Seq de las líneas pIR-PP1-240 y pIR-PP1-240T ha puesto de manifiesto la expresión diferencial de 103 y 92 genes, respectivamente. En ambas líneas, más del 80% de los cambios relativos de expresión se detectaron en el primer día 1 de la curva de crecimiento. Estos resultados se correlacionan con los elevados niveles de ARNm y proteína descritos anteriormente en los transfectantes pIR-PP1-240 y pIR-PP1-240T a día 1. Cabe destacar que, a pesar de que el análisis por RNA-Seq reveló la sobre-expresión de PP1-240 y PP1-240T en los días 1, 3 y 5 de la curva de crecimiento, la tasa de variación fue superior en el primer día que en el resto de los tiempos analizados en ambas líneas, concretamente 4 y 2,5 veces superior en pIR-PP1-240 y pIR-PP1-240T, respectivamente.

Además, los cambios globales consisten concretamente en la sub-expresión de los genes en más del 85% de los casos. De acuerdo a la terminología de Gene Ontology (GO) anotada y el análisis de enriquecimiento funcional, los genes diferencialmente expresados tanto en pIR-PP1-240 como en pIR-PP1-240T se relacionan fundamentalmente con los procesos biológicos de expresión génica, traducción,transporte de moléculas y actividades metabólicas. Sin embargo, algunos procesos metabólicos observados en pIR-PP1-240, como los procesos relativos a pteridina, no se detectaron en pIR-PP1-240T, mientras que otros como los procesos relacionados con la riboflavina o el transporte de iones metálicos son propios del transfectante pIR-PP1-240T.El análisis de agrupamiento o clustering comparativo realizado en base a la distancia euclídea aplicando el método jerárquico de War con el programa informático edgeR v.3.12.1 sobre los datos de RNA-Seq, revela perfiles de expresión similares a día 1 entre los transfectantes pIR-PP1-240 y pIR-PP1-240T. Concretamente, el estudio de los conjuntos de genes sub-expresados a día 1 refleja un total de 48 genes comunes, tanto de función conocida como codificantes de proteínas hipotéticas. De hecho, esta intersección entre ambos conjuntos representa más de la mitad del número total de genes diferencialmente expresados en ambas líneas. Por tanto, los perfiles de expresión detectados en pIR-PP1-240 y pIR-PP1-240T indican que la proteína PP1-240 mantiene cierta actividad a pesar de la deleción del extremo N-terminal.

Asimismo, los resultados sugieren que el extremo N-terminal de la proteína PP1-240 podría tener una función relevante en la interacción con ciertas proteínas reguladoras mientras que en otras dicha interacción podría llevarse a cabo a través de la superficie de la subunidad catalítica PP1-240, como se ha descrito en la mayoría de las PP1. El estudio por RNA-Seq de la línea celular pIR-PP1C-34 puso de manifiesto la expresión diferencial de 279 genes en los días 1, 3 y 5 de la curva de crecimiento. Aproximadamente el 95% de los genes diferencialmente expresados se distribuyen uniformemente entre los días 1 y 3 de la curva. Sin embargo, estos resultados no se correlacionan con la tasa de variación descrita para PP1C-34, donde se detectó una disminución gradual de los niveles de sobre-expresión a lo largo de la curva de crecimiento. El estudio detallado de los genes diferencialmente expresados en pIR-PP1C-34 ha revelado la sub-expresión de numerosos genes previamente detectados en los transfectantes pIR-PP1-240 y pIR-PP1-240T. Según los estudios de ontología génica incluyendo los análisis de enriquecimiento funcional, los genes sub-expresados a día 1 y 3 en el transfectante pIR-PP1C-34 presentan funciones biológicas relacionadas con la regulación de la expresión génica, traducción, procesos biosintéticos de macromoléculas y plegamiento de proteínas. Dichos procesos se vinculan esencialmente con los componentes celulares del núcleo, ribosomas y mitocondria. Estos resultados muestran un perfil de expresión similar al detallado en los transfectantes pIR-PP1-240 y pIR-PP1-240T. En ensayos previos de fosfoproteómica, se identificaron variaciones en los perfiles de fosforilación durante el proceso de diferenciación de los promastigotes, vinculándose dichas modificaciones post-traduccionales principalmente con las funciones celulares de inicio de la traducción, plegamiento y catabolismo de proteínas. No obstante, en el caso de pIR-PP1C-34 destaca también la sobre-expresión de diversos genes relacionados con el corpúsculo basal y los complejos de dineína, que se relacionan con la fosforilación de proteínas, el movimiento asociado a microtúbulos y la citocinesis. Este perfil de expresión, detectado exclusivamente en el transfectante pIR-PP1C-34, también se ha observado en células de mamíferos en los que se asocia la actividad fosfatasa tipo 1 con la organización del citoesqueleto. El estudio comparativo de los perfiles de expresión génica de las tres líneas knock-in generadas han revelado que la sobre-expresión de las diferentes PP1 en estudio da lugar a la sub-expresión de 45 genes en común, de los cuales 16 son de función conocida. Este hecho podría deberse al mecanismo de interacción descrito de las PP1 con las PIP, donde esta asociación se lleva a cabo fundamentalmente a través de la superficie proteica correspondiente a la región catalítica conservada de las PP1.

En síntesis, los estudios llevados a cabo en esta tesis doctoral han revelado: i) alto grado de conservación de las secuencias de las proteína-fosfatasas PP1-240 y del cluster PP1-34 de L. infantum; ii) predominio de la sub-expresión en los perfiles de expresión génica diferencial detectados en líneas knock-in de sobre expresión de las PP1 en estudio; iii) influencia de las PP1 en procesos celulares relacionados con la transcripción, traducción, modificación post-traduccional de proteínas, el ciclo celular, el transporte y las moléculas de superficie; iii) una posible implicación de la proteína PP1-240 en procesos de diferenciación celular como sugieren la sub-expresión de los marcadores de metaciclogénesis SHERP y META1 en la línea de sub-expresión pIR-PP1-240; iv) la inducción de estrés celular en las líneas de sobre-expresión de las proteína-fosfatasas en estudio por la detección de los genes A2 y peroxidasa; v) la vinculación de las proteínas codificadas por el cluster PP1-34 con procesos relacionados con el citoesqueleto y flagelo.