Desarrollo de pretratamientos enzimáticos de materiales lignocelulósicos para la obtención de bioetanol de segunda generación

Abstract

La presente Tesis aborda el estudio de pretratamientos biológicos destinados a romper la barrera de lignina y mejorar la sacarificación de los materiales lignocelulósicos utilizados en la obtención de bioetanol de segunda generación. Los pretratamientos estudiados en esta Tesis están basados en el uso del sistema enzimático lacasa-mediador y han demostrado ser eficaces en degradar/modificar la estructura del polímero de lignina que envuelve y protege a los carbohidratos. Las modificaciones en la estructura de la lignina permiten que los carbohidratos queden más expuestos a las enzimas celulasas, lo que se traduce en una mejora significativa en la hidrólisis de los mismos. Por otro lado, esta Tesis también plantea el estudio de las interacciones que tienen lugar entre la lignina y las celulasas, y que afectan al proceso de hidrólisis de la celulosa. Estos estudios tienen como objetivo un aprovechamiento más racional y eficaz de los materiales lignocelulósicos en la producción de biocombustibles de segunda generación (bioetanol). En esta Tesis se han evaluado dos sistemas lacasa-mediador. El primero está constituido por una lacasa de alto potencial redox, obtenida del hongo basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus, y el mediador redox sintético, 1-hidroxibenzotriazol (HBT). El segundo, incluye una lacasa comercial obtenida del hongo ascomiceto Myceliophthora thermophila y el mediador natural siringato de metilo (MeS). Los materiales lignocelulósicos utilizados en los pretratamientos enzimáticos con el sistema lacasa-mediador incluyeron: i) residuos agrícolas de paja de trigo, el bagazo y la paja de la caña de azúcar y ii) madera de paulownia (Paulownia fortunei). Para el estudio de las interacciones lignina-celulasa se utilizaron ligninas aisladas de eucalipto (Eucalyptus globulus), paja de trigo y pícea (Picea abies) . Los pretratamientos de materiales lignocelulósicos con lacasa de P. cinnabarinus en presencia/ausencia de HBT, se realizaron sobre dos materias primas, los residuos agrícolas de paja de trigo y de caña de azúcar, con el objeto de mejorar el rendimiento de sacarificación enzimática y obtención de bioetanol de ambas materias. Primeramente se realizaron experimentos del tratamiento sobre la paja de trigo en una secuencia que incluía un solo ciclo enzimático seguido de una extracción alcalina con peróxido de hidrógeno. Tras la secuencia se determinó el contenido en lignina (lignina Klason) y se evaluó el efecto que esta eliminación/modificación de lignina producía sobre la sacarificación enzimática (con celulasas).

Este pretratamiento produjo un descenso en el contenido en lignina del 45% respecto a la materia prima y una mejora en la obtención de glucosa del 60% tras 72 h de tratamiento con celulasas. También se analizó la modificación de la estructura de lignina con dichos tratamientos mediante resonancia magnética nuclear bidimensional (2DRMN). Estos estudios revelaron un descenso en los enlaces β-O-4´y β-5´ así como en las unidades de lignina p-hidroxifenilo (H), guayacilo (G) y siringilo (S), y una disminución más moderada de los ácidos p-cumárico y ferúlico, sin variación sustancial en la unidad de tricina. Con el objeto de estudiar la eficacia del sistema lacasa-mediador sobre otras materias primas, se estudió la aplicación del mismo sobre los residuos de la industria de la caña de azúcar (bagazo y paja), en este caso utilizando una secuencia de 4 ciclos con dosis menores de enzima y mediador por ciclo. Con esta secuencia se obtuvo un descenso en el contenido en lignina del 27% y 31% para el bagazo y paja de caña de azúcar respectivamente, y una mejora del 39% y 46% en el rendimiento de glucosa, en la materia pretratada de bagazo y paja, en comparación con el control, tras las 72 h de tratamiento con celulasas. El análisis 2D-RMN reveló notables cambios en la estructura de la estructura de la lignina, observándose en ambos materiales un descenso significativo en el número los enlaces y unidades de lignina. La eficacia del sistema lacasa-mediador volvió a quedar demostrada con el pretratamiento realizado sobre madera de paulownia con la lacasa de M. thermophila y MeS. Dicho pretratamiento constó de una secuencia de 4 ciclos (cada uno de ellos incluía un tratamiento enzimático seguido de una extracción alcalina). Los mejores resultados se obtuvieron con 50 U·g-1 de enzima y 3% de MeS, consiguiendo un descenso en lignina del 24% respecto al control y un aumento en la liberación de glucosa del 40%. Los análisis de 2D-NMR de estos materiales revelaron un descenso en el número de enlaces y un aumento de las unidades oxidadas de siringilo y guayacilo, tras el pretratamiento. Por último, se analizaron los filtrados obtenidos durante los diferentes ciclos, encontrándose compuestos oxidados de lignina como vainillina, ácido vanílico, siringaldehído y ácido siríngico, que corroboran la naturaleza oxidativa del pretratamiento y la consecuente deslignificación de los materiales lignocelulósicos. Con el fin de demostrar el efecto negativo que tiene la presencia de lignina sobre las celulasas en la hidrólisis del material lignocelulósico, se aislaron las ligninas (milled wood lignin, MWL) de diferentes materias primas (eucalipto, paja de trigo y pícea), y se estudió su efecto en la adsorción y consecuente inhibición de las celulasas (tanto sobre el cóctel enzimático, como sobre la enzima purificada) mediante microbalanza de cristal de cuarzo y resonancia de plasmón superficial. Los resultados al aplicar las celulasas sobre films recubiertos de dichas ligninas demostraron que la enzima purificada muestra menor afinidad a la adsorción sobre el film con lignina y mayor reversibilidad de unión. También se observó que la afinidad más alta en la adsorción lignina-enzima se produce en la lignina de pícea (99% unidades G) mientras que la adsorción más baja se produjo en la de eucalipto (70% unidades S).