Molecular mechanisms of monoaminergic neurons development in Caenorhabditis elegans.

Abstract

[EN] Specific cell identities are defined by the expression of selected transcriptomes that allow the cell to fulfill its distinctive functions. It is broadly stablished that transcriptomes are selected by specific combinations of transcription factors (TF) that bind selectively to the regulatory regions of the DNA, promoters and enhancers. In fact, it is the combinatorial and cooperative binding of transcription factors what promotes the expression of specific cell features. However, the mechanisms that allow TFs to identify regulatory regions remain poorly understood. One of the niches that gathers more cell diversity is the nervous system, thus, this tissue becomes one of the best scenarios to study how distinct cell fates are acquired. In this Thesis we focus on monoaminergic system (MA), composed of distinct subpopulations of neurons that use biogenic amines as neurotransmitters, such as dopamine (DA), serotonin (5-HT) and adrenaline (A) and noradrenaline (NA), in vertebrates, or octopamine (OA) and tyramine (TA) in invertebrates. Monoaminergic system is conserved in all eumetazoans and regulates a plethora of complex behaviors, from locomotion to mood or appetite. An unbalance in the production or release of these neurotransmitters leads to diseases such as Parkinson or mental disorders such as bipolar disorder, depression or anxiety. In this Thesis we took advantage of the phylogenetic conservation of monoaminergic neurons to use the nematode Caenorhabidtis elegans as a model system. C. elegans monoaminergic system is composed of four pairs of DA neurons (CEPV/D, ADE and PDE), four pairs (NSM, ADF, HSN and AIM) and a unilateral (RIH) serotonergic neurons; a pair of TA neurons (RIM) and another OA pair (RIC).

All these neurons express a battery of genes that encode for enzymes and transporters that produce, carry and release the neurotransmitter which are also phylogenetically conserved. Using this nematode, our goal in this Thesis was to unravel which, among the 876 transcription factors present in C. elegans genome, play a key role in specification of monoaminergic neurons. To accomplish this aim, we optimized the RNAi strategy to perform an RNAi screen to knockdown the expression of all C. elegans TFs and look for defects in specific features of MA neurons, such us in the battery of genes required to synthesized the neurotransmitter. This strategy provided 91 TFs candidates involved in MA specification, we selected the ones that retrieved the most penetrant phenotypes and validate the results according to the MA subpopulation affected. Our results showed that, for DA population, unc-62, vab-3 and unc-55 are essential in the regulatory complex that drives the specification of these neurons. Regarding 5-HT neurons, the combined action of lag-1 and hlh-14 promote the expression of ADF mature features and are determining in the behaviors exhibited by this neuron. Finally, the bZIP factor, zip-5, has been identified as the first TF known to be involved in the specification of RIC and RIM neurons. To conclude, our work shed light into the transcriptional regulation of monoaminergic neurons, identifying key TFs that control the expression of identity genes of this population and that can be used to find functional orthologs in more evolved organisms that control monoaminergic specification.

[ES] La identidad celular se define mediante la expresión de transcriptomas seleccionados que permiten a la célula cumplir sus funciones características. Los estudios en este campo señalan que un transcriptoma se selecciona mediante combinaciones específicas de factores de transcripción (FT) que se unen selectivamente a las regiones reguladoras del ADN, promotores y enhancers. De hecho, es la unión cooperative y en combinación de los factores de transcripción lo que promueve la expresión de características celulares específicas. Sin embargo, los mecanismos que permiten a los FT identificar regiones reguladoras siguen siendo poco conocidos. Uno de los nichos que reúne más diversidad celular es el sistema nervioso, por lo tanto, este tejido se convierte en uno de los mejores escenarios para estudiar cómo se especifican los distintos destinos celulares. En esta Tesis nos centramos en el estudio del sistema monoaminérgico (MA), compuesto por distintas subpoblaciones de neuronas que utilizan aminas biógenas como neurotransmisores, entre los que se incluyen la dopamina (DA), la serotonina (5-HT) y la adrenalina (A) y noradrenalina (NA), en vertebrados, u octopamina (OA) y tiramina (TA), en invertebrados. El sistema monoaminérgico está conservado en todos los eumetazoos y regula una gran variedad de comportamientos complejos, desde la locomoción hasta el estado de ánimo o el apetito. Un desequilibrio en la producción o liberación de estos neurotransmisores conduce a enfermedades como el Parkinson o trastornos mentales como el trastorno bipolar, la depresión o la ansiedad. En esta Tesis, aprovechamos la conservación filogenética de las neuronas monoaminérgicas para utilizar el nematodo Caenorhabidtis elegans como sistema modelo. El sistema monoaminérgico de C. elegans se compone de cuatro pares de neuronas DA (CEPV / D, ADE y PDE), cuatro pares (NSM, ADF, HSN y AIM) y una neurona serotoninérgica unilateral (RIH); un par de neuronas TA (RIM) y otro par de OA (RIC).

Todas estas neuronas expresan una batería de genes que codifican enzimas y transportadores que producen, transportan y liberan el neurotransmisor y que también está filogenéticamente conservada. Usando este nematodo, nuestro objetivo en esta Tesis fue desentrañar cuáles, entre los 876 factores de transcripción presentes en el genoma de C. elegans, juegan un papel clave en la especificación de las neuronas monoaminérgicas. Para lograr este objetivo, optimizamos la estrategia de ARN de interferencia (ARNi) para realizar un cribado de ARNi con el fin de disminuir la expresión de todos los FT de C. elegans y buscar defectos en las características específicas de las neuronas MA, como la batería de genes necesarios para sintetizar el neurotransmisor. Esta estrategia proporcionó 91 FT candidatos implicados en la especificación MA. Posteriormente seleccionamos aquellos que proporcionaron los fenotipos más penetrantes y validamos los resultados de acuerdo con la subpoblación MA afectada. Nuestros resultados mostraron que, para la población DA, unc-62, vab-3 y unc-55 son esenciales en el complejo regulador que impulsa la especificación de estas neuronas. En cuanto a las neuronas 5-HT, la acción combinada de lag-1 y hlh-14 promueve la expresión de las características de madurez de la neurona ADF y son determinantes en los comportamientos exhibidos por la misma. Finalmente, el factor bZIP, zip-5, ha sido identificado como el primer FT relacionado con la especificación de las neuronas RIC y RIM. Para concluir, nuestro trabajo arrojó luz sobre la regulación transcripcional de las neuronas monoaminérgicas, identificando FT clave que controlan la expresión de genes de identidad de esta población y que pueden usarse para encontrar ortólogos funcionales en organismos más evolucionados que también controlen la especificación monoaminérgica.