Organización bioquímica de FtsZ en sistemas mínimos de membrana y entornos citomiméticos aglomerados

Abstract

[EN] Bacterial division is an essential process highly regulated in time and space. In most bacteria, FtsZ is the major component of the divisome (molecular machinery effecting cytokinesis) which interacts with additional proteins that contribute to its function forming a dynamic ring at the midcell that is essential to constrict the membrane. FtsZ is a self-assembling GTPase, homolog of eukaryotic tubulin. The GTP-linked assembly and disassembly cycle of GTP is thought to be a key process in the formation of the division ring. The first molecular assembly of the divisome is the proto-ring, which in E. coli it is formed by FtsZ and the membrane tethering proteins ZipA, and FtsA. These proto-ring elements assemble at the cytoplasmic membrane forming a structure required for the incorporation of the remaining division proteins. Minimal membrane systems, such as nanodiscs, lipid-coated microbeads, supported lipid bilayers, droplets and vesicles, have been used as scaffolds to reconstitute the proto-ring elements in order to test their functional properties under controlled conditions. Recently, it has been shown that the surface density of ZipA is a key parameter controlling the assembly and destabilization of FtsZ polymers rendering curved polymers, which results in the emergence of chiral dynamic patterns. Along these lines, it has also been shown that the shrinkage of ZipA-containing vesicles driven by dynamic FtsZ polymers only occurs above a certain threshold ZipA density. These density-dependent transitions highlight the relevance of surface concentration of proto-ring membrane-tethered elements on modulating the behaviour of FtsZ polymers.

Reconstitution of functional divisome assemblies needs also to faithfully reproduce the crowded intracellular environment in which division takes place. Excluded volume effects due to crowding are known to have a considerable impact on the functional energetics of macromolecular reactions. For example, FtsZ assembly into high-order structures is favoured by crowding. Because crowding leads to liquid/liquid phase separation (LLPS), the cytoplasm can contain microenvironments and/or compartments in which proteins and other metabolites accumulate and perform specialized functions. In this line, there is currently a growing interest in mimicking the cellular compartmentalization by encapsulation of phase-separated systems inside lipid containers. The general objective of this thesis is to contribute to the understanding of the biochemical reactivity and organization of the essential bacterial division FtsZ protein, and how these properties are modulated by specific molecular interactions in membranes and by the crowded intracellular environment. The first two chapters of the thesis describe the quantitative characterization of the interaction between FtsZ and ZipA reconstructed in lipid-coated microbeads (Chapter 1) and supported lipid bilayers (Chapter 2). Lipid-coated microbeads allowed the immobilization of ZipA in the lipid bilayer and the measurement of FtsZ-ZipA complex formation at the vicinity of the membrane by means of differential sedimentation assays combined with fluorescence spectroscopy. The equilibrium binding of FtsZ-GTP to ZipA was found to be saturable, whereas the interaction of the GDP form of FtsZ was not. The difference between the two modes of binding could be attributed to the difference between the composition of oligomers of free FtsZ-GDP and free FtsZ-GTP formed in solution. On the other hand, the reconstitution of ZipA-FtsZ interaction in supported bilayers (Chapter 2) allowed us to demonstrate that the receptor density modulates both the binding of FtsZ-GMPCPP to ZipA and the organization of the polymer film at the membrane, as revealed by biophysical approaches (QCM-D and SE). Our studies have also established that FtsZ-GMPCPP binding to ZipA-containing bilayers occurs in two phases, corresponding to the different modes of polymer extension on the surface or to the bulk solution. Both the equilibrium binding properties and the kinetics of dissociation from the membrane of FtsZ-GMPCPP polymers were different to the ones found for the GDP form of FtsZ. The results of Chapters 1 and 2 provide insights on the mode of interaction of proto-ring elements in minimal membrane systems and contribute to complete our understanding of the initial events of bacterial division.

Next, the influence of membrane-free microcompartments resulting from crowding-induced liquid/liquid phase separation (LLPS) on the dynamic spatial organization of FtsZ was studied using several LLPS systems (Chapter 3). FtsZ was found to accumulate in one of the phases and/or at the interface, depending on the system composition and on the oligomerization state of the protein. These results were observed both in bulk LLPS and in lipid-stabilized, phase-separated aqueous microdroplets. The visualization of the droplets revealed that both the location and structural arrangement of FtsZ filaments is determined by the nature of the LLPS system. Relocation upon depolymerization of the dynamic filaments suggests the protein may shift among microenvironments in response to changes in its association state. The existence of these dynamic compartments driven by phase transitions can alter the local composition and reactivity of FtsZ during its life cycle acting as a nonspecific modulating factor of cell function. In Chapter 4, the encapsulation by microfluidics of FtsZ and a LLPS system inside microdroplets is described. These droplets were then converted into permeable giant vesicles (allowing ligand uptake), with higher yield, homogeneity and biomolecular compatibility than previously described.

[ES]La división bacteriana es un proceso esencial estrictamente regulado en el tiempo y el espacio. En la mayoría de las bacterias, FtsZ es el principal componente de la maquinaria molecular que efectúa la citocinesis, el divisoma. Esta proteína es una GTPasa homóloga de la tubulina eucariota con capacidad de autoensamblaje que interacciona con otros elementos que contribuyen a su función formando un anillo dinámico en el centro de la célula para constreñir la membrana. Este ciclo de ensamblaje y desensamblaje vinculado a GTP es un proceso clave en la formación del anillo de división. El primer complejo del divisoma es el proto-anillo que, en E. coli, está formado por FtsZ y sus proteínas de anclaje a la membrana, ZipA y FtsA, que interaccionan en la membrana citoplasmática formando una estructura esencial para la incorporación del resto de las proteínas de división. Los sistemas mínimos de membrana, tales como nanodiscos, microesferas recubiertas de lípidos, bicapas lipídicas soportadas, microgotas y vesículas se han utilizado como soportes para reconstituir los elementos del proto-anillo con el fin de analizar sus propiedades funcionales en condiciones controladas. Recientemente, se ha demostrado que la densidad superficial de ZipA es un parámetro clave en el control del ensamblaje y la desestabilización de los polímeros FtsZ que produce polímeros curvos y da como resultado la aparición de patrones dinámicos quirales. También se ha demostrado que el colapso de vesículas que contienen ZipA, inducido por los filamentos dinámicos de FtsZ, sólo ocurre por encima de cierto umbral de densidad de ZipA. Estas transiciones dependientes de la densidad demuestran la importancia de la concentración superficial de los elementos del proto-anillo que se anclan a la membrana en la modulación del comportamiento de los polímeros de FtsZ. La reconstitución de divisomas funcionales también necesita reproducir fielmente el entorno intracelular aglomerado en el que tiene lugar la división. Se ha descrito que la exclusión de volumen debida a la aglomeración macromolecular tiene un impacto notable en la energética de las reacciones macromoleculares. Por ejemplo, la condensación de FtsZ en estructuras supramoleculares se ve favorecida por la aglomeración macromolecular. Debido a que esta aglomeración puede conducir a fenómenos de separación de fases, el citoplasma puede contener microentornos y/o compartimentos en los que las proteínas y otros metabolitos se acumulan y realizan funciones especializadas. Por ello, actualmente existe un gran interés en simular la compartimentación celular mediante la encapsulación de sistemas de separación de fases dentro de contenedores lipídicos. El objetivo general de esta tesis es contribuir a la comprensión de la reactividad bioquímica y la organización de la proteína esencial de la división bacteriana FtsZ, y a estudiar cómo estas propiedades están moduladas por las interacciones moleculares específicas que ocurren en la membrana y por la aglomeración del entorno intracelular. En los dos primeros capítulos de la tesis se describe la caracterización cuantitativa

de la interacción entre FtsZ y ZipA en microesferas recubiertas de lípidos (Capítulo 1) y bicapas lipídicas soportadas (Capítulo 2). El uso de microesferas recubiertas de lípido permitió la inmovilización de ZipA en la bicapa lipídica y la caracterización de la formación del complejo FtsZ-ZipA en el entorno de la membrana, mediante ensayos de sedimentación diferencial combinados con espectroscopía de fluorescencia. Se observó que el equilibrio de unión de FtsZ-GTP con ZipA era saturable, mientras que la interacción de FtsZ-GDP no lo era. La diferencia entre los dos modos de unión podría atribuirse a la distinta composición de oligómeros de FtsZ-GDP libre y FtsZ-GTP libre formados en solución. Por otro lado, la reconstitución de la interacción ZipA-FtsZ en bicapas soportadas (Capítulo 2) y su análisis mediante aproximaciones biofísicas (QCM-D y SE) permitió demostrar que la densidad del receptor modula tanto la unión de FtsZ-GMPCPP a ZipA como la organización de los polímeros en la membrana. Estos estudios también determinaron que la unión de FtsZ-GMPCPP a las bicapas que contienen ZipA ocurre en dos fases que se corresponden con los diferentes modos de extensión del polímero: primero sobre la superficie y después hacia la solución. Tanto las propiedades de unión como la cinética de disociación de la membrana de los polímeros de FtsZ-GMPCPP fueron diferentes a las encontradas para la forma GDP. Los resultados de los Capítulos 1 y 2 proporcionan información sobre el modo de interacción de los elementos del proto-anillo en sistemas mínimos de membrana y contribuyen a completar la comprensión de los primeros eventos de la división bacteriana. A continuación, se estudió la influencia de los microcompartimentos sin membrana resultantes de la separación de fases, inducida por la aglomeración macromolecular sobre la organización espacial dinámica de FtsZ utilizando varios sistemas de separación de fases (Capítulo 3). Se observó que FtsZ se acumulaba en una de las fases y/o en la interfaz, dependiendo de la composición del sistema y del estado de oligomerización de dicha proteína. Estos resultados se observaron tanto en sistemas de separación de fases en solución como en microgotas acuosas estabilizadas con lípidos que contenían fases separadas. La visualización de las microgotas reveló que la distribución y disposición estructural de los filamentos de FtsZ están determinadas por la naturaleza del sistema de fases. La redistribución de los filamentos dinámicos tras la despolimerización sugiere que la proteína puede desplazarse entre microentornos en respuesta a cambios en su estado de asociación. La existencia de estos compartimentos dinámicos inducidos por transiciones de fase puede alterar la composición local y la reactividad de FtsZ durante su ciclo de vida, actuando como un factor modulador inespecífico de la función celular. En el Capítulo 4, se describe la encapsulación por microfluídica de FtsZ y un sistema de separación de fases dentro de microgotas. Posteriormente, a partir de estas microgotas se prepararon vesículas gigantes permeables (que permiten la captación de ligandos), con mayor rendimiento, homogeneidad y compatibilidad biomolecular que otros métodos disponibles para la producción de este tipo de vesículas.