Ingeniería de relaxasas para el ensamblaje de múltiples proteínas sobre nanoestructuras de ADN

Abstract

[EN]: In the last decade, nanostructures made from DNA have been created with any imaginable shape. For the application of these DNA-based nanostructures (DNA origamis) in biomedicine, new approaches are required for covalent coupling of proteins to DNA. In this thesis, we focused in the application of relaxases for site-specific covalent conjugation of proteins to single stranded DNA extensions on DNA origamis. Relaxases are involved in DNA processing for bacterial conjugation, which is a process of DNA transfer from a donor to a recipient cell. Relaxases are capable of forming a covalent phosphotyrosine bond with specific DNA sequences. Three of the four relaxases investigated, TrwCR388 TraIR100 and MobAR1162, showed good binding performance to DNA origamis with high specificity and orthogonality. We have also studied the relaxases as a new tool for polymerization of single and double stranded DNA (dsDNA), or even polymerization of DNA origamis. Our goal was also the improvement of the reaction performed by relaxases. For this purpose, we have modified the recognition sequence of relaxases with secondary structures mimicking the stem-loop recognized and cleaved by replicases. We have also used substrates with a permutation between the nic site and the inverted repeat (reverse conformation), and also substrates with dsDNA around the nic site. We found that the percentage of covalent complexes with TrwCR388 improved significantly with these substrates but not all the evaluated relaxases increased the yield. These studies have helped to gain more insight into the application of relaxases in the field of biotechnology.

[ES]: En la última década se han conseguido construir nanoestructuras de ADN (origamis de ADN) con cualquier forma imaginable. Para la aplicación de estos origamis de ADN en biomedicina, se requieren nuevos métodos para conseguir unir proteínas covalentemente al ADN. En esta tesis, hemos explorado la capacidad de las relaxasas para unirse de forma programada sobre nanoestructuras hechas de ADN ya que estas enzimas, implicadas en la transferencia de ADN plasmídico de una célula donadora a una célula receptora, son capaces de formar un enlace covalente fosfotirosina con secuencias específicas de ADN. Tres de las cuatro relaxasas investigadas, TrwCR388, TraIR100 y MobAR1162, mostraron un buen rendimiento de unión a origamis, con una alta especificad y ortogonalidad. También hemos estudiado las relaxasas como una nueva herramienta de polimerización de ADN sencillo, doble o incluso de origamis de ADN. Nuestro objetivo también ha sido la mejora de la reacción de las relaxasas. Para aumentar la actividad, hemos modificado la secuencia de reconocimiento de las relaxasas imitando la conformación de horquilla que reconocen las replicasas. También hemos utilizado una conformación en la que se han permutado el sitio nic y la repetición invertida (conformación inversa), e incluso con doble cadena después del sitio nic. Encontramos que el porcentaje de complejos covalentes mejoraba significativamente con TrwCR388 pero no todas las relaxasas evaluadas lo incrementaban. Estos estudios han servido para ampliar el potencial de las relaxasas como herramientas biotecnológicas.