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Título

Estudios estructura-función sobre la enzyma aril-alcohol oxidasa implicada en la biodegradación de la lignina

AutorFerreira, Patricia
DirectorMartínez, Ángel T.
Palabras claveAril-alcohol oxidasa
Flavoproteína
Oxidorreductasa
Lignina
Basidiomicetos
Biotecnología
Fecha de publicación2004
EditorCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
Universidad de Alcalá de Henares
ResumenLa biodegradación de la lignina es un proceso oxidativo, llevado a cabo por los denominados hongos de podredumbre blanca. El peróxido de hidrogeno tiene un importante papel en este proceso como precursor del radical libre hidroxilo y co-sustrato de peroxidasas ligninolíticas. La aril-alcohol oxidasa (AAO) de Pleurotus eryngii es una flavoproteína extracelular que genera H2O2 en la reacción de oxidación de la enzima por el O2, mientras que su reducción da lugar a reacciones de deshidrogenación oxidativa de diferentes alcoholes aromáticos. Esta glicoproteína es un monómero que contiene como cofactor una molécula de FAD. Su reciente clonación ha permitido la expresión heteróloga en Emericella nidulans y Escherichia coli. Este hecho, unido a las similares propiedades catalíticas de las enzimas recombinantes y salvaje (de P. eryngii), ha permitido completar la caracterización fisicoquímica, cinética y estructural de la AAO que constituye el objetivo de este trabajo. La caracterización espectrofotométrica reveló que la AAO es un oxidasa poco común, ya que no estabiliza termodinámicamente la forma semiquinona aniónica de su cofactor, ni forma un aducto con el sulfito. Estos hechos resultan más llamativos al existir un residuo con carga positiva en las inmediaciones del C4a de la flavina que debería favorecer estas reacciones. Los estudios de especificidad de sustrato pusieron de manifiesto que la AAO sólo está implicada en reacciones de oxidación de alcoholes y aldehídos, siendo incapaz de catalizar las reacciones de desmetilación, desaminación e hidroxilación descritas para otras oxidasas de alcoholes aromáticos. Los sustratos típicos de la AAO son alcoholes aromáticos o alifáticos poliinsaturados con un hidroxilo primario en el Cα. El centro activo de la AAO tiene afinidad por compuestos con sistemas de dobles enlaces conjugados, con independencia de que contengan grupos hidroxilo alcohólicos, como han puesto de manifiesto estudios de inhibición. La actividad aldehído oxidasa fue puesta de manifiesto en los estudios cinéticos utilizando mezcla rápida con flujo detenido, donde se vio que presentaba actividad frente a los aldehídos generados por la propia enzima.
Además mediante 19F NMR se pudo identificar el producto ácido de la reacción aldehído-oxidasa sobre el p-fluorobenzaldehído. Los estudios de cinética rápida con los alcoholes p-anisílico, 3-cloro-p-anisílico y veratrílico y el p-anisaldehído pusieron de manifiesto la dependencia de las cinéticas de reducción de la AAO del tipo sustrato. Los resultados obtenidos para distintas concentraciones de alcohol p-anisílico permitieron el cálculo de las constantes de reducción (k2 303 s ) y disociación (kd 34 µM) para este compuesto. La AAO presenta una moderada homología de secuencia con la glucosa oxidasa de Aspergillus niger lo que permitió su modelado por homología (entrada PDB 1QJN). La comparación de la estructura primaria de la AAO con la glucosa oxidasa y otros miembros de la familia GMC de oxidorreductasas de la que la glucosa oxidasa forma parte, reveló la existencia en la secuencia de la AAO de los cuatro motivos conservados en esta familia (aunque con dos residuos diferentes en uno de ellos, signature 1 PS000623). Este hecho, junto con las similares características estructurales encontradas, han llevado en este trabajo a incluir a la AAO de P. eryngii como un nuevo miembro de la familia GMC de oxidorreductasas. La arquitectura molecular general de la AAO presenta dos dominios estructurales: i) dominio de unión del FAD con el motivo conservado βαβ de unión al ADP; y ii) dominio de unión al sustrato. En este último se ha identificado un canal de acceso al centro activo de naturaleza fundamentalmente hidrofóbica y de características similares al observado en otras oxidasas como la glucosa oxidasa. En los estudios de acoplamiento molecular de la AAO con distintos sustratos se observó que éstos se localizaban en las inmediaciones del cofactor, pudiendo describirse un bolsillo de unión de los sustratos. Posteriores estudios de mutagenesis dirigida confirmaron el papel de alguno de los residuos del centro activo de la AAO en la actividad catalítica de la enzima. Estos estudios mostraron la necesidad de un residuo aromático en las posiciones ocupadas por Y92 y F501, ya que la actividad de la AAO se mantuvo tras las sustituciones FY o YF. Las constantes cinéticas de las variantes obtenidas sugieren que ambos residuos podrían modular el potencial redox del FAD, y Y92 podría también contribuir a la adecuada orientación de los sustratos. Simultáneamente se mostró que dos histidinas próximas al N5 del anillo de flavina (H502 y H546) y a la probable localización del hidroxilo del sustrato, son indispensables para la actividad catalítica (tal como se vio al sustituirlas por residuos de serina, leucina o arginina). Se propone que estas dos histidinas, altamente conservadas en la familia GMC de oxidorreductasas, actuarían como bases activas en la reacción de oxidación de los sustratos, a través de un mecanismo de deshidrogenación por transferencia directa de un hidruro y reducción del FAD.
Descripción158 p.-40 fig.-27 tab.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/161152
Aparece en las colecciones: (CIB) Tesis
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