Análisis de nuevas estrategias basadas en silenciamiento génico para el control de enfermedades virales en plantas

Abstract

[EN] Post-transcriptional gene silencing is a homology-dependent RNA degradation system designed to act as a natural defense of plants against virus infections. Moreover, it is known that double-stranded RNA (dsRNA) constitutes the inducer of this evolutionary conserved, adaptive defense response. In this thesis two strategies have been pursued that although different, both rely on the use of dsRNA molecules derived from viral sequences to interfere with virus infections. The first strategy was based on the stable expression of dsRNA by transgenes encoding the transcription of viral sequences arranged as inverted repeats (IR). Nicotiana benthamiana plants have been transformed with a transgene containing an inverted repeat of the 54k region of the replicase of pepper mild mottle virus (PMMoV). The expression of this construct produced the stable accumulation in plants of transcripts corresponding in length to the transgene sequence. In protection assays against PMMoV, near 70% of these regenerated R0 plants showed resistance to the virus. On the contrary, plants transformed with viral sequences arranged as direct repeats, encoding the same region of the virus but not able to form dsRNAs, showed resistance to the virus in only 6-20% of the regenerated R0 plants. PMMoV resistance was associated with the accumulation of small RNAs of 25 and 21 nts, a hallmark of PTGS, in a stage previous to viral inoculation. A dsRNA-expressing, homozygosis R2 line, IR4#8, has been characterized. This line was challenged by increasing titers of viral inoculum in the leaf and by a high and continuous supply of viral inoculum through the vascular system by grafting. In all the cases, transgenic plants displayed high resistance (immunity) to the virus until their life cycles were completed. On the other hand, when plants of this transgenic line were inoculated with other tobamoviruses with low nucleotide similarity with PMMoV, like TMV or ToMV, they showed a phenotype of susceptibility. However, these plants showed a phenotype of complete resistance when they were inoculated with PMMoV-I, a tobamovirus with high nucleotide similarity with PMMoV. These findings argue for the high specificity of the mechanism that promotes the resistance in these plants. The second strategy appears as an alternative to the genetic transformation of plants and is based on the production of dsRNAs derived from viral sequences in bacteria.

Previously, it had been demonstrated that the inoculation of virus together with dsRNA derived from viral sequences produced in vitro, prevents virus infections in plants in a sequence-specific manner. In order to obtain large amounts of virus-derived dsRNA that could be used in PTGS studies as well as for its potential use in the control of the viral diseases in plants, an inducible expression system of these molecules in bacteria has been developed. The dsRNAs corresponded to diverse genomic sequences derived from PMMoV, plum pox virus and potato virus Y.dsRNAs purified from bacteria and co-inoculated together with the homologous virus in plants of N. benthamiana and Capsicum annuum, displayed a specific interference with viral infections. Furthermore, crude extracts of bacterially expressed dsRNAs, made by lysing cell pellets with the French Press without any additional step of purification, were equally effective protecting plants against virus infection. Virus infectivity was significantly abolished when plants were sprayed with French Press lysates several days before mechanical inoculation with the virus. However, plants were not protected by this approach when inoculation of the virus was made by means of the natural vector, Myzus persicae. Nevertheless, transient expression of viral dsRNA molecules in plants yielded a total interference with the transmission of the virus by the vector, and the plants became protected from viral infection.

[ES] El silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de degradación de RNA dependiente de homología de secuencia, que actúa como un sistema natural de defensa en plantas frente a infecciones virales. Se conoce además, que el RNA bicatenario (dsRNA) constituye el inductor de esta respuesta de defensa adaptativa y altamente conservada en la evolución. En este trabajo de Tesis se han abordado dos estrategias que aunque diferentes, ambas se basan en la utilización de moléculas dsRNAs derivadas de secuencias virales para interferir con la infección de los virus. La primera estrategia se basa en la expresión de dsRNA de forma estable por transgenes que codifican la transcripción de secuencias virales dispuestas en repetición invertida (IR). En este sentido, se han obtenido líneas transgénicas de Nicotiana benthamianaen las cuales se ha introducido un transgén que contiene una repetición invertida de la región 54k de la replicasa del virus del moteado suave del pimiento (PMMoV). La expresión de esta construcción produjo la acumulación estable en la planta de un transcrito de longitud correspondiente a la secuencia transgénica. En ensayos de protección frente a PMMoV, cerca del 70% de estas líneas R0 regeneradas mostraron resistencia frente al virus. Por el contrario, construcciones dispuestas en repetición directa, que codifican la misma región del virus pero sin capacidad de hibridar intramolecularmente, mostraron resistencia al virus en tan solo un 6-20% de las plantas R0 regeneradas. La resistencia a PMMoV estuvo asociada con la acumulación de pequeños RNAs de 21 y 25 nts, característicos del PTGS, en un estadío previo a la inoculación viral. Se ha caracterizado una línea R2 en homocigosis, IR4#8, que expresa el RNA bicatenario. Esta línea ha sido sometida a títulos crecientes de inóculo viral en la hoja y a una elevada y continua presión de inóculo vía haces vasculares, mediante la utilización de injertos. En todos los casos, las plantas transgénicas presentaron elevada resistencia (inmunidad) frente al virus hasta el final del ciclo vital. Por otra parte, cuando plantas de esta línea transgénica fueron inoculadas con tobamovirus con baja similitud nucleotídica con PMMoV-S, como TMV o ToMV, éstas mostraron un fenotipo de susceptibilidad, sin embargo, cuando fueron inoculadas con PMMoV-I, un tobamovirus con elevada similitud nucleotídica con PMMoV, las plantas mostraron un fenotipo de completa resistencia, indicando esto la alta especificidad del mecanismo que promueve la resistencia en estas plantas.

La segunda estrategia se presenta como una alternativa a la transformación genética de plantas y se basa en la producción de dsRNAs derivados de secuencias virales en bacterias. Previamente había sido demostrado que la inoculación conjunta de virus y dsRNA derivado de secuencias virales producido in vitro, previene de manera específica la infección viral en plantas. Con objeto de contar con grandes cantidades de dsRNA que pudieran ser utilizadas en estudios de PTGS, así como para su potencial uso en el control de las enfermedades virales en plantas, se ha desarrollado un sistema de expresión inducible de estas moléculas en bacteria. Los dsRNAs así expresados corresponden a diversas secuencias genómicas derivadas de PMMoV, del virus de la sharka (PPV) y del virus Y de la patata (PVY). Los dsRNAs purificados a partir de bacteria y co-inoculados con el virus homólogo en plantas de N. benthamiana y Capsicum annuum, presentaron una interferencia específica con la infección viral. Además, cuando extractos crudos de dsRNAs obtenidos mediante el lisado de la bacteria por la Prensa Francesa, sin ningún paso adicional de purificación, fueron co-inoculados con el virus homólogo o pulverizados sobre la superficie foliar de las plantas, se observó que eran igualmente efectivos en la protección viral, incluso cuando la pulverización se había efectuado varios días antes de la inoculación del virus. No se obtuvo protección de las plantas por este método cuando la inoculación del virus se realizó mediante el vector Myzus persicae. Sin embargo, cuando las moléculas dsRNAs fueron expresadas transitoriamente en las plantas, se obtuvo una interferencia total con la transmisión del virus por el vector, resultando las plantas protegidas de la infección viral.