Activación conformacional inducida por DNA de la proteína iniciadora de la replicación RepA: Estudios mediante espectroscopía de fluorescencia

Abstract

La replicación theta, que transcurre a través de intermediarios de doble cadena cuyo aspecto en micrografías electrónicas se asemeja a dicha letra griega, empieza en el origen (ori), que es la mínima región requerida en cis para la replicación autónoma del plásmido, y puede ser uni o bidireccional. En general, los plásmidos que replican por este mecanismo, codifican su propia proteína iniciadora denominada Rep. El reconocimiento del origen y la organización del complejo inicial corresponde a estos iniciadores Rep y salvo las excepciones del plásmido R1 (Giraldo, R. y Diaz, R., 1992) y el fago λ (Dodson, M. y col., 1985) en las que los iniciadores se unen a secuencias inversamente repetidas en los replicones, en el resto de los casos ocurre a través de la unión a secuencias específicas del origen organizadas en repeticiones directas o iterones. El número y el espaciado entre estas secuencias son característicos de cada plásmido. Los iterones del origen suelen disponerse de modo que entre ellos haya una distancia correspondiente a un múltiplo de vuelta de hélice del DNA (10.5pb). La ocupación progresiva de dichas secuencias por la proteína iniciadora conduce a la disposición adyacente de una serie de iniciadores en la misma cara del DNA. Esta organización facilita interacciones proteína-proteína, que conllevan modificaciones topológicas en el DNA (Bramhill, D. y Kornberg, A., 1988b). En los plásmidos P1, F, R6K y pPS10, la proteína iniciadora induce curvatura en el origen tras la unión a los iterones (Kawasaki, Y. y col., 1996; Mukherjee, S. y col., 1985 Díaz-López y cols., en preparación; Mukhopadhyay, G. y Chattoraj, D.K., 1993). La acumulación de curvatura producida por la presencia de varios iterones en fase (Komori, H. y col., 1999); (Krüger, R. y col., 2004),( Díaz-López, y cols, en preparación), favorece interacciones entre las proteínas iniciadoras dando lugar a la formación del complejo nucleoproteico en el origen. Tras la unión de la proteína Rep a sus secuencias específicas en el origen, se produce la apertura de la hebra en una región adyacente rica en A+T. DnaA, la proteína iniciadora de la replicación cromosómica bacteriana, participa

en este proceso uniéndose a una o más cajas dnaA presentes en estos orígenes plasmídicos (Bramhill, D. y Kornberg, A., 1988a). RepA y DnaA atraen hacia el origen a DnaB (helicasa) que procede a la extensión de la burbuja de replicación separando las hebras del DNA. A estas últimas se unen a tetrámeros de la proteína SSB (proteína de unión a cadena sencilla), estabilizándolas impidiendo la formación de nuevo de la doble hélice. La elongación mediante la síntesis de la nueva cadena por la acción de la DNA polimerasa III, a partir de mRNA cebador sintetizado por DnaG (primasa), completa la primera etapa de inicio de replicación. Las proteínas de replicación plasmídicas se encuentran en estado dimérico en solución (García de Viedma, D. y col., 1995);(García de Viedma, D. y col., 1996); (Ingmer, H. y col., 1995), (Ishiai, M. y col., 1994), (DasGupta, a. y col., 1993). Dado que la unión de proteínas a los iterones implica formas monoméricas (con la posible excepción del plásmido R6K), se hace necesaria la transición a monómeros para garantizar la actividad de las proteínas Rep. Esto queda demostrado en replicones como F y pPSC101, en los que la unión a las secuencias repetidas del origen y el inicio de la replicación implica a la forma monomérica de la proteína iniciadora, mientras que los dímeros actúan como represores transcripcionales (Abhyankar, M. y col., 2003);(Ishiai, M. y col., 1994), (Manen, D. y col., 1992)) uniéndose a la secuencia inversamente repetida del operador. En R6K, la situación es compleja, pues los dímeros de la proteína iniciadora π, comparten con los monómeros la capacidad de unirse a los iterones del origen (Urh, M. y col., 1998);(Wu, J. y col., 1997)) probablemente actuando como reguladores de la replicación ((Filutowicz, M. y col., 1986);(Masson, L. y Ray, D.S., 1986); (Germino, J. y Bastia, D., 1983).