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Título

Dinámica de la topología del DNA durante la replicación

AutorCastán, Alicia
DirectorSchvartzman, Jorge Bernardo
Fecha de publicación2017
EditorCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
Universidad Complutense de Madrid
Resumen[EN] How DNA replicates is a critical question to understand life. The replication process is very complex and is highly regulated. Many molecules are implicated in this process which is not fully characterized. In this Doctoral Thesis, we tried to improve the knowledge about replication using different approaches. Nowadays, in the scientific community, there is not a consensus as to whether or not swiveling of the replication fork and formation of pre-catenanes can occur in vivo. In the first part of this Thesis we tried to find out if replication forks can swivel during replication. To achieve this goal, we examined the topology of three bacterial plasmids with the fork stalled at different sites after initiation. These plasmids were used to transform two different E. coli strain, one of which had Topoisomerase IV (Topo IV) active in vivo and the other one had it inactive. We isolated replication intermediates (RIs) which were analyzed by high-resolution two-dimensional agarose gel electrophoresis. The results obtained indicated that RIs were more torsionally tensioned when they were isolated from cells without Topo IV. This observation strongly suggests that forks can swivel in vivo leading to the formation of precatenanes as replication progresses.
In a second part, we studied different characteristics about replication fork barriers (RFBs). These barriers are in the rDNA of all eukaryotic organisms and they are very important for the cells because in the rDNA transcription and replication occur at the same time. If there would be no RFBs, the replication and transcription machineries could collide. RFBs block those replication forks moving in the opposite direction to transcription. We investigated and quantified the efficiency of RFBs to stall replication forks. To this end, we transfected S. cerevisiae cells with circular artificial yeast minichromosomes containing different copies of RFBs. To identify fork stalling we used two-dimensional agarose gel electrophoresis to analyze the RIs. We obtained several results that allowed us to conclude that blockage of replication forks at the budding yeast s RFBs when occurred were permanent, but this blockage only occurred in some cases.In the last stage, we tried to improve the knowledge about the replication process first step: the initiation. We wanted to know if the binding of initiator proteins to DNA is related to changes in DNA topology. We used minichromosomes derived from viral genomes in Human Embryonic Kidney (HEK) 293 cells. This system is frequently used as a model to study DNA eukaryotic replication because it is very simple and it is well characterized. We used two minichromosomes: one derivative of the Epstein-Barr Virus (EBV) and the other one derivative of the Simian Virus 40 (SV40). In both of them replication initiates at a precise site upon binding of a specific protein: the Epstein-Barr Nuclear Antigen 1 (EBNA1) and the large tumor (T) antigen, respectively. We transfected HEK293 variant cells that constitutively express either the EBNA1 protein (HEK293E) or SV40 large T antigen (HEK293T). We isolated extrachromosomal DNA and use two-dimensional agarose gel electrophoresis to analyze them. We concluded that the union of initiator proteins to DNA does not affect the minichromosomes DNA topology.
[ES] Comprender cómo replica el DNA es una cuestión crítica para entender la vida. La replicación del DNA es un proceso muy complejo y altamente regulado, en el que están implicadas una gran cantidad de moléculas. Hoy por hoy, este proceso no está plenamente caracterizado. En la presente Tesis Doctoral se ha intentado profundizar en la comprensión de la replicación del DNA utilizando diferentes aproximaciones a lo largo de sus distintas etapas. Actualmente no existe un consenso entre los miembros de la comunidad científica acerca de si las horquillas replicativas pueden girar libremente in vivo durante la replicación con la consecuente formación de pre-encadenados. En una primera fase de la presente Tesis Doctoral se aportó información acerca de esta cuestión, tratando de contestar a la pregunta de si las horquillas pueden girar durante la replicación. Para ello se analizó la topología de tres plásmidos bacterianos derivados de pBR322 que conteníanla secuencia para la terminación TerE clonada a distintas distancias del origen de replicación. Con estos plásmidos se transformaron dos estirpes distintas de E. coli, una proficiente y otra deficiente en la Topoisomerasa IV (Topo IV). Se aislaron intermediarios de replicación (RIs) que se analizaron mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa. Los resultados obtenidos indican que los RIs aislados de las células con la Topo IV inactiva presentan un nivel de torsión mayor que los aislados de la estirpe con la Topo IV activa. Esta observación sugiere que las horquillas pueden girar libremente in vivo a medida que avanza la replicación. En una segunda etapa, se estudiaron diferentes características de las barreras replicativas naturales (RFBs) presentes en el rDNA. Estas barreras, que están presentes en todos los organismos eucariotas estudiados hasta el momento, son sumamente importantes para las células ya que en el rDNA los procesos de transcripción y replicación se llevan a cabo de forma simultánea.
La replicación del rDNA ocurre mientras estos genes son transcripcionalmente activos. Por tanto, si una horquilla de replicación intenta atravesar una unidad de rDNA en la dirección opuesta a la transcripción, el complejo de replicación podría colisionar con el de transcripción, pudiendo tener consecuencias letales para la célula. Para estudiar dichas barreras se han utilizado varios minicromosomas artificiales de levaduras, a los cuales se les clonaron distinto número de RFBs. Se transformaron células de S. cerevisiae y se extrajeron RIs que se digirieron con distintas enzimas de restricción para obtener dos fragmentos lineales de DNA, que fueron analizados por electroforesis bidimensional. Los resultados obtenidos permitieron concluir que las barreras replicativas naturales clonadas en minicromosomas artificiales de levaduras, detienen de manera permanente las horquillas. Sin embargo, no son capaces de detener el 100% de las mismas. Por último, se intentó profundizar en el conocimiento de la primera fase del proceso de replicación: la iniciación. Concretamente se trató de determinar si la unión de proteínas iniciadoras de la replicación induce cambios topológicos en el DNA. Para ello se utilizaron minicromosomas derivados de genomas víricos transfectados en células humanas (HEK293). Este sistema es ampliamente utilizado para estudiar la replicación en organismos eucariotas, ya que los minicromosomas están sometidos a restricciones muy similares a las de la célula huésped, pero representan un sistema mucho más simple y mejor caracterizado. Se utilizaron dos minicromosomas, uno derivado del genoma del virus de Epstein-Barr (EBV) y otro derivado del virus del simio 40 (SV40). Ambos necesitan la presencia de sendas proteínas víricas para replicar de forma autónoma y extracromosómicamente. Dichas proteínas, EBNA1 y el Antígeno T, respectivamente, son las responsables de la iniciación de la replicación. Se transfectaron dos subtipos de células HEK293, que expresan de manera constitutiva EBNA1 (HEK293E) o el Antígeno T (HEK293T). Posteriormente, se aisló el DNA extracromosómico que se analizó mediante electroforesis bidimensional. Se pudo concluir que la unión de distintas proteínas iniciadoras no afecta a la topología de estos minicromosomas.
Descripción141 p.-36 fig.-1 tab.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/156650
Aparece en las colecciones: (CIB) Tesis
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