Nuevos biomarcadores y dianas terapúticas en cancer colorectal metastásico

Abstract

[EN] Colorectal cancer (CRC) is the fourth most worldwide deadly cancer due to the metastatic development of the disease. For this reason, efforts are focused on the prediction and treatment of CRC metastases. Metastatic tumor cells undergo a series of alterations, for example in their capacity of adhesion and invasion, which allow them to colonize, survive and proliferate in distal organs. At present, molecular mechanisms and proteins responsible for hepatic and pulmonary colonization of colon tumor cells are not known. Recently, our laboratory has identified CDH17 and IL13R2, and the molecular mechanisms through which they function, for hepatic colonization of CCR cells. To search for biomarkers associated with diseases such as cancer, "omic" techniques are used to identify, quantify and characterize thousands of genes and/or proteins in complex biological samples. Our laboratory has used these techniques, such as protein microarrays or quantitative proteomics, identifying a total of 43 tumor associated antigens, including FGFR4 and PIM1, which could function as CRC biomarkers. These advances are of great importance, since few proteins have been described as CRC biomarkers. Goals: In this context, the work developed in this Doctoral Thesis has attempted to advance in the knowledge of the mechanisms involved in CRC metastasis, with the final aim of finding new metastasis biomarkers and therapeutic targets for this disease. Results and Discussion: Using quantitative proteomics tools, we have characterized the altered mechanisms in CRC metastasis, discovering that the alterations in metastatic cells with respect to tumor cells are broader than previously described, and encompass processes such as lipid and glycoproteins metabolism, sub-cellular protein localization and mitochondrial organization, among others. On the other hand, we have identified a number of potential metastatic CRC biomarkers, whose overexpression is associated with poorer survival, including PLOD1, a protein never before related to cancer, and QSOX1, whose involvement in metastasis of cancer has begun to be studied. Within the proteins identified as deregulated proteins in CRC metastasis were LOXL1 and PAUF.

LOXL1 is an extracellular matrix protein, necessary for lung colonization of breast cancer cells. In this work we observe that LOXL1 is overexpressed in the secretoma of highly metastatic CCR cells KM12L4, which in particular, metastasize to the lung. We have observed that LOXL1 is involved in the pro-metastatic processes of cell adhesion and invasion, and found, thanks to the study of its interactome, that it can participate, at least in CRC, in other biological processes such as the Wnt canonical signaling pathway and regulation of intra- and extra-cellular transport. In conclusion, we started the study of the relationship between LOXL1 and CRC, discovering that LOXL1, like in breast cancer, participates in cell adhesion and invasion, and may be a determinant for lung colonization of KM12L4 cells. On the other hand, we have analyzed for the first time the role in CRC of PAUF, a poorly known protein, upregulated in pancreatic cancer, where it participates in processes of cell adhesion, migration and invasion. We identified PAUF as a protein whose expression decreases in the primary colon tumor to subsequently increase in liver metastasis of CRC, and corroborated its effect on cell adhesion and invasion. We observed that PAUF is located in the nucleus and cytosol, distributed in a very similar way to APC. In addition, its silencing causes increase in nuclear size, displacement of the cell cycle profile, errors in mitosis, decreased cell proliferation, as well as great chromosomal instability, suggesting its participation in the mitotic checkpoint. The analysis of its interactome corroborated this function, identifying numerous proteins belonging to the mitotic checkpoint, among which was APC. APC expression decreases after silencing of PAUF, and is accompanied by a decrease in E-cadherin expression, and an increase in nuclear -catenin, suggesting that loss of PAUF could promote the epithelial-mesenchymal transition and tumor progression. Finally, we have observed that the silencing of PAUF sensitizes APC-deficient CCR cells to treatment with certain types of drugs, such as taxol. In short, we characterized PAUF as a mitotic checkpoint protein, important for the maintenance of chromosomal stability in CRC, and whose silencing, combined with the use of different drugs, could be a good strategy to follow for the treatment of patients with CRC. Conclusions: In this Doctoral Thesis we have expanded the knowledge of the altered mechanisms in the CRC metastasis, as well as identifying a series of proteins as potential biomarkers of this disease. In addition, we have analysed for the first time the role of LOXL1 and PAUF in CRC.

[ES] El cáncer colorrectal (CCR) es el cuarto cáncer más mortal a nivel mundial, debido al desarrollo metastásico de la enfermedad. Por esta razón, parte de los esfuerzos se focalizan en la predicción y el tratamiento de la metástasis de CCR. Las células tumorales metastásicas sufren una serie de alteraciones, por ejemplo en su capacidad de adhesión e invasión, que les permiten colonizar, sobrevivir y proliferar en órganos distales. Actualmente, no se conocen con exactitud los mecanismos moleculares ni las proteínas responsables de la colonización hepática y pulmonar de las células tumorales de colon. Recientemente, nuestro laboratorio identificó a CDH17 e IL13R2, y los mecanismos moleculares a través de los cuales son necesarias para la colonización hepática de las células de CCR. Para la búsqueda de biomarcadores asociados a enfermedades como el cáncer, se utilizan técnicas ómicas , que permiten identificar, cuantificar y caracterizar miles de genes o proteínas en muestras biológicas complejas. Nuestro laboratorio ha utilizado estas técnicas, como microarrays de proteínas o proteómica cuantitativa, identificando un total de 43 antígenos asociados a tumor, entre los que se encontraban FGFR4 y PIM1, que podrían funcionar como biomarcadores de CCR. Estos avances son de gran importancia, ya que pocas proteínas se han descrito como biomarcadores de esta enfermedad. Objetivos: En este contexto, el trabajo desarrollado en esta Tesis Doctoral ha pretendido avanzar en el conocimiento de los mecanismos implicados en la metástasis de CCR, con el fin último de encontrar nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas de la metástasis de esta enfermedad. Resultados y discusión: Mediante la utilización de herramientas de proteómica cuantitativa, hemos caracterizado los mecanismos alterados en la metástasis de CCR, observando que las alteraciones en las células metastásicas respecto de las células tumorales son más amplias de lo descrito hasta ahora, y abarcan procesos como metabolismo de lípidos y glicoproteínas, localización proteica sub-celular y organización mitocondrial, entre otros. Por otro lado, hemos identificado una serie de potenciales biomarcadores de la metástasis de CCR, cuya sobreexpresión se relaciona con peor supervivencia a la enfermedad, destacando PLOD1, una proteína nunca antes relacionada con cáncer, y QSOX1, proteína cuya implicación en la metástasis del cáncer se ha empezado a estudiar.

Dentro de las proteínas identificadas como proteínas desreguladas en la metástasis de CCR se encontraban LOXL1 y PAUF. LOXL1 es una proteína de matriz extracelular, necesaria para la colonización pulmonar de células de cáncer de mama. En este trabajo observamos que LOXL1 se sobre-expresa en el secretoma de células altamente metastásicas de CCR KM12L4, que particularmente, metastatizan a pulmón. Observamos que LOXL1 está involucrada en los procesos pro-metastásicos de adhesión e invasión celular, y encontramos, gracias al estudio de su interactoma, que puede participar, al menos en CCR, en otros procesos biológicos como la vía de señalización canónica de Wnt o la regulación del transporte intra- y extra-celular. En definitiva, iniciamos el estudio de la relación existente entre LOXL1 y CCR observando que LOXL1, al igual que sucede en cáncer de mama, participa en adhesión e invasión celular, pudiendo ser determinante para la colonización pulmonar de las células KM12L4. Por otro lado, caracterizamos por primera vez el papel en CCR de PAUF, una proteína poco conocida, regulada al alza en cáncer de páncreas, donde participa en procesos de adhesión, migración e invasión celular. Identificamos a PAUF como una proteína cuya expresión disminuye en el tumor primario de colon para posteriormente aumentar en la metástasis hepática de CCR, y corroboramos su efecto sobre adhesión e invasión celular. Observamos que PAUF se localiza en el núcleo y en el citosol, distribuyéndose de manera muy similar a APC. Además, su silenciamiento provoca aumento del tamaño nuclear, desplazamiento del perfil de ciclo celular, errores en las mitosis, diminución de la proliferación celular, así como gran inestabilidad cromosómica, sugiriendo su participación en el checkpoint mitótico. El análisis de su interactoma corroboró esta función, identificándose numerosas proteínas pertenecientes al checkpoint mitótico, entre las que se encontraba APC. La expresión de APC disminuye después del silenciamiento de PAUF y se acompaña de una disminución de la expresión de E-cadherina y de un aumento de -catenina nuclear, sugiriendo que la pérdida de PAUF podría promover la transición epitelio-mesénquima y la progresión tumoral de CCR. Por último, observamos que el silenciamiento de PAUF sensibiliza a células de CCR deficientes en APC al tratamiento con determinados tipos de drogas, como por ejemplo, el taxol. En definitiva, caracterizamos a PAUF como una proteína del checkpoint mitótico, importante para el mantenimiento de la estabilidad cromosómica en CCR, y cuyo silenciamiento, combinado con el uso de diferentes drogas, podría ser una buena estrategia a seguir para el tratamiento de pacientes con CCR. Conclusiones: En esta Tesis Doctoral hemos ampliado el conocimiento de los mecanismos alterados en la metástasis de CCR, identificando, además, una serie de proteínas como potenciales biomarcadores de la enfermedad. Además, hemos caracterizado por primera vez el papel de LOXL1 y PAUF en CCR.