Estudio estructural y funcional del mecanismo de transducción de señal por Sistemas de Dos Componentes canónicos y atípicos.

Abstract

[EN] Signal transduction systems based on phosphorylation cascades are the most common systems and among them, Two Component Systems (TCSs) are the main ones in bacterial organisms. TCS are based on two proteins, a transmembrane dimeric histidine kinase (HK) and a cytosolic response regulator (RR). The intracellular region is composed of regulatory domains and the DHp and CA catalytic domains. The CA domain is the ATP binding domain that brings phosphate γ from the ATP to the phosphoaceptic His located in the DHp domain for its phosphorylation in the autophosphorylation reaction. Subsequently the phosphoryl group is transferred to a conserved Asp residue in the catalytic domain of the RR. The last of the reactions is the dephosphorylation of the RR to end the system response that can be given in a self-sufficient way by the RR, although normally it is accelerated by the HK. The study of the autophosphorylation in the HKs allowed the resolution of the structure of EnvZchim in an autophosphorylation state. This, together with the functional studies, has allowed us to describe in detail the process as well as to characterize both the asymmetry and the cis or trans directionality of the reaction. The location of a key region in the DHp for the HK-RR interaction allowed us to characterize the NblS-RpaB/SrrA-SipA atypical system which requires the interaction of its HK, NblS, with two RRs RpaB and SrrA. The different specificity of this HK by its RRs has been approached in this work through in silico studies along with the structural characterization of some of the components of the system. On the other hand, our studies in the process of activation and dimerization in the canonical RRs OmpR and PhoB after obtaining the structure of the domain REC of the OmpR RR, allowed us to decipher the key residues in the homodimerization specificity in canonical RRs after its activation by phosphorylation. The use of reporter genes controlled by the OmpR RR and the use of flow cytometry has proved to be a good technique for detecting possible cases of heterodimerization between RRs. In the study of atypical TCSs, our results with the MaeK-MaeR system confirmed a system formed by a degenerate HK unable to autophosphorylate and by a RR whose activation by canonical phosphorylation generates a "swapped" dimerization barely known in the RRs. Another RR of interest was NblR, an orphan RR whose mechanism of activation is unknown and has two important Cys and a Tyr in its activation state that possibly entails its oligomerization for the regulation of the nblA promoter. Our work in the knowledge of the TCSs has allowed us to know better the mechanism of action of these systems and to embark on the search for inhibitory compounds of the autophosphorylation in HKs as possible antibacterial drugs by means of crystallographic tests and in vitro and in vivo tests on HKs model that allow us to find the best antibacterial compound.

[ES] Los sistemas de señalización y transducción de la señal basados en cascadas de fosforilación son los sistemas más comunes y, entre ellos, los Sistemas de Dos Componentes (TCSs) son los principales en organismos bacterianos. Los TCS se basan en dos proteínas, una histidina quinasa (HK) dimérica transmembrana y un regulador de la respuesta (RR) citosólico. La región intracelular se compone de dominios reguladores y de los dominios catalíticos DHp y CA. El dominio CA es el dominio de unión de ATP que acerca al fosfato γ del ATP a la His fosfoaceptora localizada en el dominio DHp para su fosforilación en la reacción de autofosforilación. Posteriormente el grupo fosforilo es transferido a un residuo de Asp conservado en el dominio catalítico o REC del RR. La última de las reacciones es la desfosforilación del RR para finalizar la respuesta del sistema que puede darse de manera autosuficiente por parte del RR aunque normalmente se ve acelerada por la HK. El estudio de la autofosforilación en las HKs nos permitió la resolución de la estructura de EnvZchim en estado de autofosforilación. Esto, junto con los estudios funcionales, nos ha permitido describir en detalle el proceso así como caracterizar tanto la asimetría como la direccionalidad cis o trans de la reacción. La localización de una región en el DHp clave en la interacción HK-RR, nos permitió caracterizar el sistema atípico NblS-RpaB/SrrA-SipA el cual requiere de la interacción de su HK, NblS, con dos RRs RpaB y SrrA. La diferente especificidad de esta HK por sus RRs se ha abordado en este trabajo mediante estudios in silico junto con la caracterización estructural de algunos de los componentes del sistema. Por otro lado, nuestros estudios en el proceso de activación y dimerización en los RRs canónicos OmpR y PhoB tras la obtención de la estructura del dominio REC del RR OmpR, nos ha permitido descifrar los residuos claves en la especificidad de la homodimerización en RRs canónicos tras su activación por fosforilación. La utilización de genes reporteros controlados por el RR OmpR y el uso de citometría de flujo ha resultado ser una buena técnica para la detección posibles casos de heterodimerización entre RRs. En el estudio de TCSs atípicos, nuestros resultados con el sistema MaeK-MaeR confirmaron un sistema formado por una HK degenerada incapaz de autofosforilarse y por un RR cuya activación por fosforilación de manera canónica genera una dimerización tipo “swapped” apenas conocida en los RRs. Otro RR de interés fue NblR, un RR huérfano cuyo mecanismo de activación es desconocido que y posee dos Cys y una Tyr importantes en su estado de activación que posiblemente conlleva su oligomerización para la regulación del promotor nblA. Nuestro trabajo en el conocimiento de los TCSs nos ha permitido conocer mejor el mecanismo de acción de estos sistemas y embarcarnos en la búsqueda de compuestos inhibidores de la autofosforilación en las HKs como posibles fármacos antibacterianos mediante ensayos cristalográficos y ensayos in vitro e in vivo sobre HKs modelo que nos permitan dar con el mejor compuesto antibacteriano.