Construcción de tetrámeros híbridos de la fosfofructokinasa M de mamíferos para su análisis estructural y funcional

Abstract

La fosfofructokinasa (PFK) de mamíferos es un enzima tetramérico organizado como un dímero de dímeros. En el isozima M se ha mostrado que los dos sitios catalíticos para fructosa 6-fosfato en un dímero están localizados en la interfase entre las mitades N-terminales, mientras que los dos sitios alostéricos para fructosas bisfosfato pertenecen a las mitades C-terminales. La primera reconstrucción tridimensional de PFK-M obtenida recientemente mediante microscopía electrónica (Arechaga et al FASEB J. 24:4960-8, 2010) reveló que los dos dímeros en el tetrámero no muestran una misma conformación, existiendo una separación entre las subunidades de uno de ellos que impide la formación de los sitios para fructosas fosfato, a diferencia de lo que ocurre en el otro dímero. Esto implicaría una marcada diferencia funcional entre ambos dímeros. Pretendemos explorar esta posibilidad mediante la producción de tetrámeros híbridos formados por diferente proporción de subunidades salvajes y subunidades que tengan dañado el sitio para fructosa 6-fosfato. Para ello hemos generado las mutaciones H199E, R201E, R292E y H298E en PFK-M. Los enzimas mutantes fusionados a una etiqueta Flag para favorecer la separación posterior de los tetrámeros híbridos fueron purificados y caracterizados, encontrando que H199E, R292E y H298E disminuyen marcadamente la afinidad por fructosa 6-fosfato, sin modificar significativamente otras propiedades del enzima. Hemos generado tetrámeros híbridos entre H199E y el enzima salvaje mediante su disociación por dilución y posterior asociación, y estamos actualmente abordando la separación cromatográfica de los híbridos para su caracterización estructural y funcional.