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Título

Implicación de AMPK en la señalización intracelular inducida por CCR₇ en las células dendríticas

AutorLópez-Cotarelo, Pilar
DirectorRodríguez-Fernández, José Luis
Palabras claveAMPK
Células dendríticas
CCR7
Señalización intracelular
Apoptosis
Fecha de publicación2017
EditorCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
Universidad Complutense de Madrid
Resumen[EN] Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells capable of initiating the immune response by activating naive T lymphocytes. In their last phase of differentiation called mature CD (mDCs), these cells present antigens captured in the areas of inflammation to lymphocytes in the lymph nodes. To carry out this role, mCDs must migrate through the afferent lymphatics to the lymph nodes. The chemokine receptor CCR7, which is expressed by mDCs, is key to direct these cells to the lymph nodes. Before, it has been shown that CCR7 relays intracellular signaling resulting in the extension of the survival of mDCs. However, the mechanisms used by this receptor to promote survival are not completely understood. AMPK (AMP-dependent Kinase) is a sensor of energy status that can detect changes in the AMP/ATP ratio. This enzyme responds to increased levels of AMP by inducing activation of catabolic and inhibition of anabolic pathways. In this thesis, it was investigated whether AMPK plays a role in CCR7-dependent regulation of survival in DCs. We first analyzed whether AMPK kinase played a pro-apoptotic or a pro-survival role in DCs. Reduction of AMPK levels using siRNA increases the survival of human mDCs. We suggest that AMPK induces specifically apoptosis because it promotes morphological and biochemical changes associated with this type of cell death. In this regard, AMPK induces nuclear pyknosis and fragmentation and as well as a caspase-dependent cell death that involves the specific activation of caspase-3.
Activation of AMPK also induces apoptosis of DCs in vivo, as shown in experiments where apoptosis was analyzed in popliteal lymph nodes. The data presented indicate that AMPK may induce apoptosis in DCs through two mechanisms. First, AMPK may induce translocation of the transcription factor FOXO1 from the cytoplasm to the nucleus. Once in the nucleus, FOXO1 activates the transcription of the pro-apoptotic Bcl2 family member Bim. Second, AMPK inhibits the activity of the pro-survival kinase complex mTORC1. We also investigated the mechanism whereby CCR7 regulates AMPK activity in mat DCs. The data obtained show that CCR7 stimulation induced a rapid phosphorylation of AMPK at Ser485, a residue that inhibits the activity of this enzyme. The inhibition of AMPK activity was also supported by the decrease in the phosphorylated/activated form of the AMPK target Acetyl-CoA carboxylase. Studies using pharmacological inhibitors show that downstream of CCR7, Gαi and Gβγ subunits of protein G mediate AMPK inhibition. Although it has been shown that the kinases Akt, S6k and PKA are able to directly phosphorylate AMPK at Ser485 in several cell types, we show that these kinases are not involved in CCR7-dependent phosphorylation of AMPK in DCs. Instead, it was found that downstream of CCR7, MEK1/2 and ERK1/2 are the key kinases inducing, phosphorylation of AMPK on Ser485. Co-immunoprecipitation experiments showed that ERK and AMPK may be components of a signaling complex that induces phosphorylation/inhibition of AMPK. Proximity ligation assays (PLA) indicate that CCR7 stimulation of DCs induces proximity between ERK and AMPK (≤40 nm), consistent with the possibility of interaction between these molecules. In conclusion, the data presented, suggest that CCR7 uses the MEK/ERK/AMPK signaling pathway, in addition to the Akt pathway, as a complementary mechanism to switch-off pro-apoptotic signaling and to promote survival in DCs. Taken together, the data show that AMPK may be a new potential target to modulate the function of mat DC in the immune system.
[ES] Las células dendríticas son células presentadoras de antígenos profesionales capaces de activar a los linfocitos T vírgenes e iniciar la respuesta inmune adaptativa. En su fase final de diferenciación, denominada fase de CD maduras (CDms), estos leucocitos pueden migrar a través de los vasos linfáticos aferentes hasta los ganglios linfáticos, donde presentan los antígenos capturados en las áreas de inflamación a los linfocitos T. Las CDms maduras expresan el receptor de quimioquinas CCR7 que es fundamental para que estas células se dirijan a los ganglios linfáticos. En trabajos previos se mostró que la activación de CCR7 aumenta la supervivencia de las CDms, aunque los mecanismos de señalización que regulan este proceso no se conocen por completo. AMPK (AMP-dependent Kinase) es una molécula considerada un “guardián energético” celular debido a que es capaz de detectar cambios en la proporción AMP/ATP. En respuesta a un aumento de los niveles de AMP, AMPK activa las rutas de señalización catabólicas e inhibe las anabólicas. En esta tesis se estudia la posible implicación de AMPK en la regulación de la supervivencia de las CDs mediada por CCR7. En primer lugar, analizamos si AMPK tiene un papel inductor de la supervivencia o de la apoptosis en las CDs. La reducción de los niveles de AMPK con un siRNA provoca un aumento de la supervivencia de las CDms, lo que indica que AMPK induce muerte en las CDs. Se sugiere que la activación de AMPK provoca una muerte de tipo apoptótico porque morfológicamente implica procesos de picnosis y de fragmentación del núcleo y bioquímicamente depende de caspasas, implicando específicamente a la caspasa-3. Los experimentos en los que se analizó la supervivencia de las células en los ganglios linfáticos mostraron que AMPK induce apoptosis de las CDs in vivo. Además, los resultados obtenidos indican que AMPK induce la apoptosis de las CDs mediante al menos dos mecanismos.
Primero, la activación de AMPK induce la translocación del factor de transcripción FOXO1 del citoplasma al núcleo. Una vez en el núcleo, FOXO1 activa la transcripción de la proteína pro-apoptótica Bim, miembro de la familia Bcl2. Segundo, la activación de AMPK inhibe la actividad del complejo pro-supervivencia mTORC1 en las CDs. También investigamos los mecanismos empleados por CCR7 para regular la actividad de AMPK en las CDms. Los resultados muestran que la estimulación de CCR7 induce una rápida fosforilación de AMPK en la Ser485, un residuo que inhibe la actividad de la enzima. Además, la estimulación de CCR7 también induce una disminución en los niveles de fosforilación de AMPK en la Thr172 (posición activadora) y una disminución en la forma fosforilada/inhibida de la Acetil-CoA carboxilasa, una diana de AMPK. Además, los estudios con inhibidores farmacológicos muestran que la inhibición de AMPK está mediada por las subunidades Gαi y Gβγ de la proteína G. Aunque se ha descrito en diferentes tipos celulares que las quinasas Akt, S6k y PKA fosforilan directamente a AMPK en la Ser485, mostramos que tras la estimulación de CCR7, ninguna de estas tres quinasas está implicada en la fosforilación de AMPK. En su lugar, los resultados indican que son MEK1/2 y ERK1/2 las quinasas clave en la inducción de la fosforilación de AMPK en la Ser485. En este sentido, los experimentos de co-inmunoprecipitación muestran que ERK y AMPK pueden ser componentes de un mismo complejo de señalización que induce la inhibición de AMPK. Además, los ensayos de ligación por proximidad (PLA) indican que la estimulación de CCR7 en las CDs induce la aproximación entre ERK y AMPK (≤40 nm), lo que es consistente con la posibilidad de que estas dos moléculas interaccionen directamente. En resumen, la información presentada sugiere que CCR7 emplea, además de la ruta de Akt, también la ruta de señalización de MEK/ERK/AMPK como mecanismo complementario para apagar la señalización pro-apoptótica y promover la supervivencia de las CDs. En su conjunto, los resultados presentados muestran que AMPK puede ser una posible diana terapéutica para modular la función de las CDms y la respuesta inmune.
Descripción101 p.-25 fig.-Anexos
URIhttp://hdl.handle.net/10261/152601
Aparece en las colecciones: (CIB) Tesis
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