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Por favor, use este identificador para citar o enlazar a este item: http://hdl.handle.net/10261/152102
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Título

New hypocholesterolemic ingredients obtained from edible mushrooms

Otros títulosNuevos ingredientes alimentarios hipocolesterolemicos obtenidos a partir de hongos comestibles
AutorGil-Ramírez, Alicia
DirectorSoler-Rivas, Cristina ; Marin, Francisco R.
Fecha de publicación2015
EditorCSIC-UAM - Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL)
Resumen[EN]: The aim of this PhD. thesis was to evaluate the potential of edible mushrooms as novel sources of natural hypocholesterolemic compounds to develop specific food products with cholesterol lowering properties. However, cholesterol levels are strictly regulated to maintain its homeostasis therefore, if it is not absorbed with the diet, the cholesterol biosynthetic pathway is enhanced and vice versa. Nowadays, the commonly prescribed therapeutic treatments for hypocholesterolemic patients are targeted toward the reduction of both cholesterol intestinal absorption and/or its endogenous biosynthesis. But, when hypercholesterolemia is still moderate the consumption of food products with cholesterol-lowering capacities are more desirable than drugs. The marketed food supplemented with hypocholesterolemic compounds are only inhibiting mechanisms for cholesterol absorption. Consequently, in this work experiments were conducted to design a specific food supplemented with fungal extracts able of modulating cholesterol levels by both strategies as pharmaceutical drugs. Previous reports suggested that some of the fungal hypocholesterolemic compounds exerted their activity via different mechanisms i.e. inhibiting the pancreatic lipase (PL) during digestion process or limiting the activity of the 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl CoA reductase (HMGCR), the key enzyme in the cholesterol biosynthetic pathway (due to the presence of lovastatin) etc. However, when several mushroom extracts were tested using an in vitrodigestion model that mimics the in vivo physiological conditions in gut, no interesting PL inhibition was noticed in strains that showed certain inhibitory capacity with in vitroenzymatic tests and therefore no further studies were performed. On the other hand, lovastatin was not detected in extracts of mushrooms showing high HMGCR inhibitory activity thus, further identification of the responsible compounds was carried out. Specific water soluble polysaccharides with different structures depending on the mushroom specie were pointed as HMGCR inhibitors. They could be extracted from mushrooms with traditional and advanced technologies (such as pressurized liquid extraction, PLE or supercritical fluid extraction, SFE) and depending on the mushroom specie, their fragments could also retain their inhibitory activity at least until molecular weights of 1 KDa.
When digested (in vitro) and applied to cell cultures resembling the enterocytic barrier (Caco2), they were detected at the basolateral compartment indicating that they were partly bioavailable and when the bioavailable fraction was applied to hepatic cell cultures (HepG2), they were able of modulating the expression of genes related to the cholesterol metabolism. However, the transcriptomic response was not directed toward a specific metabolic pathway suggesting that the changes observed in mRNAs profiles might be an indirect result of post-transcriptional events then, in vivo experiments were carried out using Lentinula edodes extracts. Other compounds investigated for their potentially as hypocholesterolemic molecules were the fungal dietary fibers (DF). DF-fractions obtained by classical and advanced methods such as pressurized water extraction (PWE) containing mainly β-glucans and lower levels of chitins and α-glucans. They were acting as scavengers of bile acids during an in vitro digestion model with only a slightly lower effectivity than β-glucans extracted from cereals. When applied to Caco2 cells they modulated a few cholesterol-related genes but differently depending on the studied mushroom specie. DF-fraction from Pleurotus ostreatus was selected and further tested to elucidate in vivohypocholesterolemic influence. Fungal sterols were also studied in detail because of their structural similarity with plant sterols (phytosterols/phytostanols). They could be extracted from mushroom fruiting bodies and from their by-products by PLE and SFE although sterol yields were higher in the latter. Obtained fractions contained mainly ergosterol although other derivatives were also found in quantities specie-dependent. Ergosterol and particularly SFE extracts obtained from Agaricus bisporus displaced cholesterol from dietary mixed micelles (DMM) more effectively than β-sitosterol using an in vitrodigestion model where DMMs were isolated. The mixture of ergosterol-enriched extracts with fungal β-glucans reduced even more the presence of cholesterol in DMMs. When applied to Caco2 cell cultures they modified the transcriptional pattern of genes related to the cholesterol metabolism and also later on, the pattern of HepG2 cells. SFE-extracts were further used for animal trials. In vivo studies using normo-and hypercholesterolemic mice models were carried out following different experimental settings depending on the mushroom extract investigated. None of the tested fungal extracts were able to lower significantly cholesterol levels in plasma and only some of them reduced triglycerides levels in liver. However, fungal sterols down-regulated genes involved in the cholesterol homeostasis (such as Srebf2and Nr1h4(FXR)) and the other mentioned extracts also stimulated transcriptional profiles similar to simvastatin or ezetimibe (two hypocholesterolemic drugs). Therefore, the three extracts were separately or pooled together into a high-lipid containing food matrix (simulating unhealthy dietary habits) and given in higher doses to mice during 4 weeks together with a high-cholesterol diet. All the extracts lowered cholesterol levels in serum particularly the β-glucan extracts, but the modulated transcriptomic response was different than the one noticed by direct administration of the extracts. This and other observations suggested that the hypocholesterolemic effect of mushrooms extracts could be due to posttranscriptional changes being the observed modulations result of indirect effects. Moreover, the supplemented food including the mixture of the extracts showed similar hypocholesterolemic activities than the separate extracts indicating no positive synergies.
[ES]: El objetivo de esta tesis ha sido la evaluación de hongos comestibles,como nueva fuente de compuestos naturales hipocolesterolemicos, para el desarrollo de productos alimenticios específicos con propiedades reductoras de los niveles de colesterol. Sin embargo, con el fin de mantener la homeostasis del colesterol los niveles del mismo se encuentran estrictamente regulados, de tal manera que si el colesterol no es absorbido con la dieta, la vía de síntesis endógena se ve reforzada y viceversa. Hoy en día, los tratamientos terapéuticos comúnmente prescritos, a pacientes que sufren de hipocolesterolemia, están dirigidos hacia la reducción de la absorción intestinal de colesterol y/o su biosíntesis endógena. Sin embargo, en casos de hipercolesterolemia moderada, el consumo de alimentos beneficiosos para la salud y con capacidad dereducir los niveles de colesterol podría ser más adecuado que el uso de fármacos. La comercialización de productos alimenticios suplementados con compuestos hipocolesterolemicos se centran en la inhibición de los mecanismos de absorción del colesterol. En consecuencia, en este trabajo se detallan los experimentos llevados a cabo para diseñar un alimento suplementado con extractos naturales de origen fúngico, capaces de modular ambas estrategias, tal y como actúan las drogas farmacéuticas. Informes anteriores al presente trabajo sugirieron que los compuestos fúngicos hipocolesterolemicos pueden ejercer dicha actividad por diversos mecanismos de acción, mediante la inhibición de la lipasa pancreática (PL) durante el proceso de digestión o limitando la actividad de la 3-hidroxi-3-metil-glutaril CoA reductasa (HMGCR), enzima clave de la biosíntesis de colesterol (debido a la posible presencia de lovastatina), etc…Sin embargo, la capacidad inhibidora de la PL que mostraron determinadas cepas de hongos tras su evaluación con test químicos in vitro, no mostraron ningún efecto sobre la actividad de la PL una vez sometidos a un modelo de digestión in vitro que simula las condiciones fisiológicas in vivo del intestino. Por tanto, no se realizaron estudios adicionales. De manera adicional, no se detectó la presencia de lovastatina en aquellos extractos de hongos con capacidad inhibidora de la actividad HMGCR; por tanto, se llevó a cabo la identificación de los compuestos responsables de dicha actividad inhibitoria; señalándose como inhibidores de la HMGCR a polisacáridos solubles en agua, estructuralmente dependientes de la especie de
hongo. La extracción de dichos polisacáridos se puede realizar mediante el uso de tecnologías tradicionales y avanzadas (como puede ser la extracción con líquidos presurizados, PLE o la extracción con fluidos supercríticos, SFE) y, dependiendo de la especie de hongo, distintos tipos de fragmentos conservan su actividad inhibidora, al menos hasta pesos moleculares de 1KDa. Un una vez digeridos (in vitro) y aplicados a cultivos celulares que asemejan a la barrera entérica (Caco2), se detectaron dichas estructuras en el compartimento basolateral indicando que, al menos parcialmente, son biodisponibles. Posteriormente, células hepáticas (HepG2) tratadas con dicha fracción biodisponible mostraron cierta modulación en la expresión de genes relacionados con el metabolismo del colesterol. Sin embargo, la respuesta transcriptómica no se centró de forma específica en una vía metabólica en concreto, sugiriendo que los cambios observados en los perfiles de ARNm pueden ser resultado indirecto de eventos post-transcripcionales. Por consiguiente, se evaluó el efecto de los extractos obtenidos a partir de L. edodesen modelos experimentales in vivo. Las fibras dietéticas (DF) de origen fúngico resultan un grupo ampliamente investigado debido a su potencial hipocolesterolemico. Las fracciones DF obtenidas mediante el uso de métodos de extracción tradicionales y avanzados, como extracción con agua presurizada (PWE), contienen principalmente β-glucanos y, en menor proporción, quitinas y α-glucanos. Dichas fracciones actuaron como captadores de ácidos biliares tras ser sometidos a un modelo de digestión in vitro con tan sólo una ligera reducción respecto a la efectividad mostrada por β- glucanos extraídos de cereales. Los extractos aplicados a las células Caco2 modularon ciertos genes relacionados con el metabolismo del colesterol aunque este efecto resultó ser diferente dependiendo de la especie estudiada. La fracción DF de P. ostreatus se seleccionó y posteriormente se evaluó su influencia hipocolesterolemica en condiciones in vivo. A su vez, se llevó a cabo un estudio en detalle de los esteroles de origen fúngico debido a su similitud estructural con los esteroles vegetales (fitosteroles/fitostanoles). Dichos compuestos se pudieron extraer tanto del cuerpo fructífero así como de los productos de desecho de los hongos mediante el empleo de tecnologías de extracción como PLE y SFE, aunque esta última técnica permitió elevados rendimientos en cuanto a porcentaje de esteroles referidos a extracto. Las fracciones obtenidas contuvieron principalmente ergosterol seguido de derivados del mismo en cantidades que dependieron de la especie de partida. Las micelas mixtas de digestión (DMM) aisladas del resto de componentes de la digestión in vitro de extractos obtenidos por tecnología SFE (así como ergosterol), mostraron capacidad de desplazamiento el colesterol de dichas micelas de una forma más efectiva que el β-sitosterol. La mezcla de extractos enriquecidos en ergosterol con β-glucans de origen fúngico redujo aún más la presencia de colesterol en las DMM. Los extractos enriquecidos en esteroles fúngicos demostraron capacidad moduladora en el patrón de trascripción de genes relacionados con el metabolismo del colesterol en células Caco2, extendiendo su efecto en células hepáticas (HepG2). Las fracciones obtenidas mediante el uso de tecnología SFE fueron seleccionadas para los ensayos con animales. Posteriormente,
se llevaron a cabo estudios in vivo con modelos de ratones normo- e hipercolesterolemicos, siguiendo diferentes parámetros experimentales en función del extracto de hongo. Ninguno de los extractos de hongos analizados fueron capaces de disminuir los niveles de colesterol en el plasma de manera significativa y sólo algunos de ellos redujeron los niveles de triglicéridos en el hígado. Sin embargo, los esteroles de origen fúngico fueron capaces de disminuir la trascripción de genes involucrados en la homeostasis del colesterol (como Srebf2 y Nr1h4(FXR)); en cuanto a los otros extractos mencionados dieron lugar a perfiles de transcripción similares a aquellos obtenidos tras la administración de simvastatina y ezetimibe (dos fármacos hipocolesterolemicos). Por lo tanto, los tres extractos por separado y la mezcla de los mismos se adicionaron a una matriz alimentaria de alto contenido lipídico (simulando hábitos alimentarios poco saludables) y se administraron a los ratones en dosis superiores a las utilizadas en los ensayos in vivo, anteriormente mencionados, durante 4 semanas junto con una dieta alta en colesterol. Todos los extractos y en especial los extractos de β-glucanos, redujeron significativamente los niveles de colesterol en suero sin embargo, la modulación en la respuesta transcriptómica fue diferente a la obtenida tras la aplicación directa de éstos. A partir de éstas, y de otras observaciones detalladas en la presente memoria, se sugirió que el efecto hipocolesterolemico de los extractos de hongos podría deberse a cambios posttranscripcionales, siendo las modulaciones génicas observadas resultado de efectos indirectos. Sumando a esto, el producto alimenticio suplementado con la mezcla de los tres extractos mostró efectos hipocolesterolémicos similares a cada una de las fracciones de manera individual, indicando la ausencia de sinergias positivas
DescripciónMemoria presentada por Alicia Gil Ramírez para optar al grado de Doctor en Biología y Ciencias de la Alimentación con Mención Internacional por la Universidad Autónoma de Madrid, Departamento de Química-Física Aplicada, Sección Departamental de Ciencias de la Alimentación y realizada en el Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL).
URIhttp://hdl.handle.net/10261/152102
Aparece en las colecciones: (CIAL) Tesis
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