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Título

Endoglina soluble: mecanismo de generación y función en células endoteliales y su efecto en el remodelado vascular.

AutorGallardo-Vara, Eunate
DirectorBernabéu, Carmelo
Palabras claveCélulas endoteliales
Patología vascular
Factores de transcripción
Endoglina
TGF-beta
Metaloproteasas
KLF6
Fecha de publicación2017
EditorCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
Universidad Complutense de Madrid
Resumen[EN] Endoglin is a transmembrane homodimeric glycoprotein that plays a key role in angiogenesis and vascular remodeling, acting as a co-receptor of TGF-β family members in endothelial cells, and modulating the TGF-β signaling pathway through ALK-1 / ALK5. Mutations in endoglin gene are responsible for a rare disease known as Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HHT), associated with recurrent bleedings and arteriovenous malformations. Endothelial damage in HHT has been postulated as one of the possible "second events" necessary for the formation of arteriovenous malformations. Under endothelial damage, the transcription factor Krüppel-Like-Factor 6 (KLF6) translocates into the cell nucleus to regulate a variety of target genes involved in endothelial repair and vascular remodeling, including components of the membrane TGF-β receptor family complex such as endoglin and ALK1. While most of endoglin studies have focused on the two membrane isoforms, the regulation and role of soluble endoglin are poorly understood. It is already known that membrane metalloproteinase 14 (MMP14) targets membrane endoglin in endothelial cells to release soluble endoglin to the medium. Soluble endoglin is involved in many cardiovascular, inflammatory and tumor pathologies, and it is known to have an antiangiogenic function. The fact that some of the treatments used for HHT have antiangiogenic properties raises the question of whether this soluble endoglin can modulate the arteriovenous malformations.Objectives: The general objective of this thesis is to study the expression of soluble endoglin during endothelial damage, as well as its function on endothelial cells and on the processes of angiogenesis and vascular remodeling. To better understand this goal, it has been divided into three more specific objectives: • Study the in vitro effect of endothelial damage on the regulated expression of the membrane metalloproteinase MMP14 and endoglin, as well as the release of soluble endoglin. • Descriptive analysis of the in vitro effect of soluble endoglin on proteins and endothelial genes involved in angiogenesis processes. • Study the effect of soluble endoglin on arteriovenous malformations produced in retinas of a murine model Knock out for Eng gene.
Results: After an in vitro denudation of human endothelial cell monolayers, it was observed that the gene expression of the transcription factor KLF6 was increased in the central hours of wounding, followed by an increase of MMP14 and, consequently, a release of soluble endoglin. Concomitant to this process, MMP14 co-localized with endoglin on the membrane of cells with a migratory phenotype. In addition, an endothelial denudation performed in a femoral artery of a Klf6+/- transgenic mice showed lower levels of MMP14 in their vasculature, compared to their control littermates Klf6+/+. It was also found that overexpression of KLF6 produced an increase in the MMP14 gene transcription rate, and also in the transcriptional activity of different MMP14 promoter constructions. Chromatin immunoprecipitation experiments showed that KLF6 was able to interact with different regions of the MMP14 promoter, and this interaction was enhanced after endothelial damage. All these results suggested that KLF6 was acting as a master regulator during endothelial damage, repair and migration and may play an important role in pathophysiological processes, triggering an increase of soluble endoglin, among other factors. In order to analyze the action of soluble endoglin in angiogenesis and in development of arteriovenous malformations, human endothelial cells (HUVECs) and mouse endothelial cells (MLECs), control and Knock out for the Eng gene, were used as in vitro models. The in vivo model of postnatal retinal neovascularization of Engfl/fl-VECre-ERT mice was also used to generate an endothelial cell specific endoglin gene depletion. Treatments with soluble endoglin were performed on endothelial cells, and proteins of the secretome were analyzed using iTRAQ technology or angiogenesis arrays. Levels of proteins with a proangiogenic and pro-migratory function were diminished when endothelial cells were treated with soluble endoglin, emphasizing its previously described antiangiogenic effect. On the other hand, when Eng-KO endothelial cells were treated with soluble endoglin, it appeared to modulate some proteins that were increased or decreased, by restoring their levels respect to a control genotype Eng+/+. Further results from this thesis showed that soluble endoglin modulates the TGF-β signaling pathway activating the ALK5-Smad 2/3-PAI-1 pathway.
After the intraocular treatment of soluble endoglin in Eng-KO mice retinas, the effect on arteriovenous malformations and other physical parameters of the vasculature were analyzed. This study showed that soluble endoglin injection in Eng-KO mice partially restored the phenotype toward an Eng-WT murine model, decreasing the number of arteriovenous malformations. These results reveal a new function for soluble endoglin as a possible regulator of the abnormal vasculature in HHT1. Conclusions: • During vascular remodeling after endothelial damage, expression of endoglin and MMP14 increase and also co-localize at the cell membrane, increasing the levels of soluble endoglin released to the media as a result of increased MMP14 activity and the specific proteolytic cleavage of its target, endoglin. • The transcription factor KLF6 is involved in the increment of MMP14 expression during endothelial damage and in the activation of MMP14 gene promoter expression through its binding to the GC rich regions. • The transcription factor KLF6 can be considered as a "master regulator" during the process of endothelial damage, activating genes involved in angiogenesis and vascular remodeling, such as ENG, ALK1, IL-6 and MMP14. • High concentrations of soluble endoglin inhibit endothelial cell migration and angiogenesis by decreasing the expression of some pro-angiogenic proteins that are released into the medium, such as VEGF and FGF. • Soluble endoglin activates the pro-inflammatory pathways STAT/IL-6 and NFκB, and modulates other proteins from the TGF-β signaling pathway through the ALK5 receptor, pathway related to the endothelial quiescent state and inhibition of angiogenesis. • The proteomic analysis of secretomes from HUVECs treated with soluble endoglin, performed by iTRAQ and angiogenic arrays, indicates that soluble endoglin modulates important biological functions of angiogenic processes, acting as antiangiogenic protein. • Soluble endoglin injected intraocularly into retinas of the inducible murine model Eng Knock Out (Eng-iKOe), modulates several parameters of the abnormal retinal vasculature (number of capillary junctions, vein length, migration and vascular density), and decreases the area covered by abnormal vessels, as well as the width and number of arteriovenous malformations, thus favoring the normalization of vessels.
[ES] Endoglina es una glicoproteína homodimérica transmembrana que cumple un papel fundamental en la angiogénesis y remodelado vascular, actuando como co-receptor en la señalización de TGF-β de la célula endotelial y modulando la vía de señalización a través de ALK-1/ALK5. Mutaciones en heterocigosis del gen de endoglina causan una enfermedad rara conocida como Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT), caracterizada por sangrados recurrentes y malformaciones arteriovenosas. En HHT, el daño endotelial se ha postulado como uno de los posibles “segundos eventos” necesarios para que se produzcan estas malformaciones arteriovenosas. Bajo un daño endotelial el factor de transcripción Krüppel-like-factor 6 (KLF6) se transloca al núcleo para regular diferentes genes diana involucrados en reparación endotelial, incluyendo entre ellos componentes de la familia de TGF-β como endoglina y ALK1. Mientras que la mayoría de los estudios sobre endoglina se han focalizado en sus isoformas de membrana, poco se conoce de la regulación y el papel que puede jugar la endoglina soluble. Se sabe que es liberada al medio como consecuencia del corte de endoglina de membrana por la metaloproteinasa MMP14 en las células endoteliales; que está aumentada en diversas patologías cardiovasculares, inflamatorias y tumorales; y que tiene, principalmente, una función antiangiogénica. El hecho de que algunos de los medicamentos usados en el tratamiento para HHT tengan propiedades antiangiogénicas, plantea la cuestión de si endoglina soluble puede tener también una acción beneficiosa en la prevención y tratamiento de las malformaciones arteriovenosas. Objetivos: El objetivo general de esta tesis es profundizar en la regulación de la liberación de endoglina soluble durante el daño endotelial, así como en la función de ésta sobre las células endoteliales y los procesos de angiogénesis y remodelado vascular. En base a su mejor comprensión, se procedió a dividirlo en tres objetivos más específicos: • Estudio del efecto in vitro del daño endotelial sobre la regulación de la expresión en la membrana celular de la metaloproteinasa MMP14 y de endoglina, así como en la liberación de endoglina soluble. • Análisis descriptivo del efecto in vitro de endoglina soluble sobre proteínas y genes endoteliales implicados en angiogénesis. • Estudio del efecto de endoglina soluble sobre las malformaciones arteriovenosas producidas en retinas de un modelo murino iKOe para endoglina.
Resultados: Tras realizar un daño endotelial in vitro en una monocapa de células endoteliales humanas, se pudo observar que la transcripción génica del factor KLF6 se incrementaba en las horas centrales de cierre de herida, seguido de un aumento de MMP14 y, por consiguiente, de una mayor liberación de endoglina soluble. Concomitante a este proceso, MMP14 co-localizó con endoglina en la membrana de las células con un fenotipo más migratorio. Adicionalmente, tras una denudación endotelial in vivo en la arteria femoral de ratones transgénicos Klf6+/- se detectaron menores niveles de MMP14 en su vasculatura, comparado con sus controles Klf6+/+. Igualmente, la sobreexpresión de KLF6 producía tanto un aumento de la transcripción génica de MMP14 como un incremento muy marcado en la actividad transcripcional de diferentes construcciones del promotor de MMP14. Mediante inmunoprecipitación de cromatina, se demostró que KLF6 interacciona con distintas regiones del promotor de MMP14 y que esta interacción es mayor tras el daño endotelial. Todos estos resultados sugerían que KLF6 estaba actuando como un regulador clave durante el daño endotelial, reparación y migración, y que puede jugar un papel muy importante en procesos fisiopatológicos, desencadenando un aumento de endoglina soluble entre otros factores. Con la finalidad de analizar la acción de endoglina soluble en angiogénesis y desarrollo de malformaciones arteriovenosas, se utilizaron como modelos in vitro células endoteliales humanas (HUVECs) y células endoteliales de ratón (MLECs), tanto controles como Knock out para el gen de Eng, y el modelo in vivo de neovascularización de retina postnatal de ratones Engfl/fl-VECre-ERT, para generar una depleción génica de endoglina específica en las células endoteliales. Sobre las células endoteliales se realizaron tratamientos con endoglina soluble y se analizó el secretoma, bien mediante la tecnología iTRAQ o bien con arrays angiogénicos. Tras este análisis, se pudieron detectar proteínas consideradas fundamentalmente pro-angiogénicas que disminuían su expresión cuando las células endoteliales control eran tratadas con endoglina soluble, recalcando así su efecto antiangiogénico ya descrito. Por el contrario, cuando las células endoteliales Eng-KO eran tratadas con endoglina soluble, se producía un aumento o disminución de los niveles de algunas proteínas, de forma que se restablecían los niveles que tenían dichas proteínas en las células control Eng+/+. Además, resultados de esta tesis muestran que endoglina soluble modula la ruta de señalización de TGF-β activando la vía ALK5-Smad2/3-PAI1 y disminuyendo, por tanto, la vía de ALK1-Smad1/5/8-Id1. Con el modelo in vivo, se pudo analizar tras un tratamiento intraocular de endoglina soluble, el efecto de ésta sobre las malformaciones arteriovenosas en retinas de ratones Eng-iKOe y sobre otros parámetros físicos de la vasculatura. Este estudio permitió comprobar que endoglina soluble normalizaba parcialmente el fenotipo del modelo murino Eng-iKOe, disminuyendo el número de malformaciones arteriovenosas. Estos resultados revelan una nueva función de endoglina soluble como un posible regulador de la vasculatura anormal en HHT1.
Conclusiones: • Durante el remodelado vascular que se produce tras el daño endotelial, aumenta la expresión de endoglina y MMP14 y ambas proteínas co-localizan en la membrana, incrementando los niveles de endoglina soluble liberada al medio como consecuencia del aumento de la actividad de MMP14 y el corte proteolítico de su diana, endoglina. • El factor de transcripción KLF6 está implicado tanto en el aumento de la expresión de MMP14 durante el daño endotelial como en la transactivación del promotor del gen MMP14 mediante su unión a las regiones ricas en GC. • El factor de transcripción KLF6 puede considerarse como un “Regulador maestro” durante el proceso de daño endotelial activando genes implicados en la angiogénesis y remodelado vascular como son ENG, ALK1, IL-6 y MMP14. • Altas concentraciones de endoglina soluble, inhiben la migración endotelial y la angiogénesis disminuyendo la expresión de determinadas proteínas pro-angiogénicas que se liberan al medio como VEGF y FGF. • La endoglina soluble activa la ruta pro-inflamatoria STAT/IL-6 y NFκB, y modula otras proteínas de la ruta de señalización de TGF-β a través del receptor ALK5, vía relacionada con el estado de quiescencia e inhibición de la angiogénesis. • El análisis proteómico del secretoma de HUVECs y MLECs tratadas con endoglina soluble, indica que ésta modula la expresión de diversas proteínas clave en procesos angiogénicos. • La endoglina soluble inyectada de forma intraocular en retinas del modelo murino inducible Knock out para el gen de Eng (Eng-iKOe), modula diversos parámetros de la vasculatura anómala de la retina (número de uniones capilares, longitud de venas, migración y densidad vascular), y disminuye tanto el área cubierta por vasos anómalos, como el ancho y número de malformaciones arteriovenosas, favoreciendo con todo ello la normalización de los vasos.
Descripción224 p.-71 fig.-8 tab.-anexos.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/151741
Aparece en las colecciones: (CIB) Tesis
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