Determinación de la masa molecular de pectinas por HP-SEC. Optimización de la detección por ELSD y por RID

Abstract

Las pectinas son polisacáridos complejos presentes en la pared celular de plantas superiores con aplicaciones farmacéuticas y en la industria alimentaria donde destacan por su poder emulsificante, texturizante y gelificante. El dominio más abundante en la molécula de pectina es el homogalacturonano (HG), formado por residuos de ácido galacturónico (GalA) unidos mediante enlaces =(1=4) y cuyos grupos carboxilos están parcialmente metilesterificados en el carbono 6. Está cadena junto con otros dominios compuestos por ramnosa y GalA y otros azúcares constituyen el esqueleto de la pectina. La complejidad de este polisacárido se incrementa, ya que su estructura puede cambiar según el método de obtención y posterior procesamiento lo que dificulta su elucidación estructural 1. Por ello, es preciso disponer de metodología analítica robusta que facilite dicha elucidación siendo la masa molecular (Mw) uno de los parámetros más característicos e importantes. Hasta ahora, la mayoría de los métodos están basados en la separación por Cromatografía de Exclusión Molecular (HP-SEC) acoplada a detectores por índice de refracción (RID), de baja sensibilidad y escasa versatilidad. Sin embargo, existe un creciente interés hacia la utilización de detectores de dispersión de luz evaporativo (ELSD) que mejoran la detección sin las limitaciones que presenta el RID2. En este trabajo se ha realizado un estudio comparativo entre la detección por ELSD y RID para la determinación de la Mw de pectinas mediante HP-SEC, optimizándose las condiciones de trabajo en ambos sistemas. En el ELSD, se realizó un diseño experimental centrado en las caras (CCD) y se usaron pululanos patrón de diferentes Mw (0.342 - 805 kDa) obteniéndose como condiciones idóneas: 73 y 63ºC para las temperaturas de evaporación y nebulización, respectivamente y 0,9 mL/min el flujo de aire. Las curvas de calibrado para la estimación de Mw obtenidas para ELSD (10 - 2250 mg/L) y RID (10 - 7500 mg/L) fueron similares siendo los coeficientes de correlación (R2) mayores de 0,997. Los límites de detección y cuantificación del ELSD variaron en función de la Mw 3,1-12,4 mg/L y 15-28,3 mg/L, mientras que en RID permanecieron constantes siendo 30 y 100 mg/L, respectivamente. Estos resultados demostraron la idoneidad de la cuantificación mediante ELSD para el análisis de pectinas con Mw analizar pectinas con Mw 705 kDa.