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Azúcares y Proteínas: El papel de la dinámica en las interacciones moleculares

AutorUnione, Luca
DirectorJiménez-Barbero, Jesús ; Cañada, F. Javier
Palabras claveHidratos de Carbono
Resonancia magnética nuclear
Interacciones moleculares
Dinamica molecular
Química Biológica
Fecha de publicación2016
EditorCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
Universidad Complutense de Madrid
Resumen[EN] Glycans are among the most varied and complex molecules in biological systems. The different branches of the tree of life could be differentiated on the basis of the glycan composition of the own glycoconjugate molecules. However, how much we already know about glycans and glycoconjugate function and distribution is still an open question. Not so many years ago our knowledge about protein N-glycosylation was considerably scarce. In fact, while protein N-glycosylation was once believed to be limited to eukaryotes, it is now firmly established that this complex modification also occurs in bacteria and archaea. Consequently, in the past 10 years, the field of protein glycosylation has witnessed enormous strides in the discovery of new and unusual carbohydrates, in the elucidation of the enzymes involved in glycan assembly and processing, and in the understanding the biological impact that these glycan modifications have on the structure and function of target protein. The reason for this “late” discovery probably lies in the intrinsic structural complexity, heterogeneity and flexibility of glycans. As counterweight, numerous and exhaustive works in glycomics have demonstrated that it is due to their structural complexity, heterogeneity and flexibility why glycans have been selected as key intermediates for cell proliferation, differentiation, adhesion, infection, communication, etc. With this thesis we have tried to look inside into glycan structure, with the aim to reconcile their structural features at the atomic level with the reasons of their molecular flexibility at a more complex scale. When glycans are recognized by their receptors, their intrinsic flexibility and the plasticity of the whole system has enormous effects in the molecular recognition phenomenon. In fact, both partners involved in the intermolecular interaction could adapt their contact surface in a way that enhances enthalpy-based favourable intermolecular interactions. Alternatively or simultaneously, the glycan and the receptor could strategically keep internal molecular motions, even in the bound state, in a way that minimizes the entropy penalty to the binding event. As consequence, the role of enthalpy/entropic compensation is not easy to predict and even, to assess.
Along this thesis we have explored these features, focusing our attention on sugar protein interactions, starting from the sugar flexibility at the monosaccharide level, passing then to the study of disaccharides, and later investigating the complex motions within a sugar receptor. Finally, CH/ intermolecular interactions, which essentially contribute to the stability of sugar-protein complexes, have also been discussed and a new strategy for their direct detection has been proposed. Chapter I. The introduction of this thesis is focused on the sugar code, how key biological information is stored into glycan structure and how this message is read and is translated by specific glycan receptors. The use of stable and useful glycomimetics with bio-medical and spectroscopic interest is also presented. The chapter concludes with a description of the experimental methods that have been employed in this thesis to elucidate glycan structure and interaction. Chapter II. In this chapter, we discuss sugar flexibility at the monosaccharide level. Herein, a new generation of fluorine-containing glycomimetics is presented. We have applied a combination of NMR spectroscopy and computational methods to investigate the conformational behaviour of idose- and glucose-like rings. We have used low-temperature NMR experiments to slow down the conformational exchange of the six-membered rings. Under these conditions, the exchange rate becomes slow in the 19F NMR chemical shift time scale and allows shedding light on the thermodynamic and kinetic features of the dynamic equilibrium. Chapter III. From the monosaccharide to the disaccharide level. In this chapter, we discuss the origin of glycosidic linkage flexibility. Specifically, the use of molecular mimicry has provided key findings in glycan engineering and on how to modulate relevant stereoelectronic components that define the population distribution for the possible glycoside conformations. By using NMR methods and theoretical calculations, we have shown that it is possible to restore the anomeric effect for an acetal when replacing one of the oxygen atoms by a CF2 group. Chapter IV. A flexible paradigmatic glycan receptor. Protein dynamics related to function are still- ill-defined energetically. In this chapter, we have used GGBP, the glucose-galactose binding protein, as a model to define a functional conformational landscape, both structurally and energetically, by using an innovative approach that combines paramagnetic NMR experiments and MD simulations. Our results demonstrate that the protein, in its unbounded state, coexists between open-like and closed-like conformations, with an exchange rate around 25 ns. However, despite such conformational heterogeneity, the presence of the ligand is the ultimate driving force to unbalance the equilibrium toward the closed form. These results demonstrate that, even in this case, ligand recognition event cannot be described by pure “induced fit” or pure “conformational selection” modes.
Chapter V. CH/& interactions are essential for many intermolecular recognition processes. In glycan-protein complexes, these weak interactions involve the &-system on an aromatic residue on the protein, as acceptor, and the polarized CH moiety on the sugar, as donor. Despite their common spread, which has been identified from the detailed X-ray or NMR-based structural analysis of the complex, their direct detection by experimental means at atomic resolution has still been elusive. We herein propose that NMR could provide direct evidences for the existence of a weak intermolecular scalar J coupling between the donor and the acceptor. In this chapter, we discuss preliminary results devoted to the design of an appropriate isotope labelling scheme that could improve the necessary experimental sensitivity. Chapter VI. The general conclusions arising from the different investigations that have been performed during this phD student program are here presented.
[ES] Los glicanos constituyen unos de los tipos de moléculas más variadas y complejas de los sistemas biológicos. Las diferentes ramas del árbol de la vida se pueden distinguir en base a la composición de los glicanos que componen los glicoconjugados. Sin embargo, cuánto conocemos acerca de la función y distribución de los glicanos y glicoconjugados es una cuestión todavía abierta. Hace no demasiados años, nuestro conocimiento acerca de las glicoproteinas era considerablemente escaso. De hecho, durante mucho tiempo se creyó que la N-glicosilación de las proteínas se daba sólo en los organismos eucariotas. Sin embargo, hoy está firmemente establecido que esta compleja modificación ocurre también en bacterias y arqueas. Así, en los últimos 10 años, el campo de las glicoproteínas ha sido testigo de enormes avances en el descubrimiento de nuevos e inusuales carbohidratos, así como en la elucidación de las enzimas responsables de la construcción y el procesamiento de glicanos, y en la comprensión del impacto biológico que estas modificaciones tienen sobre la estructura y función de la proteína glicosilada. La razón de este “retraso”, probablemente radica en la intrínseca complejidad estructural, heterogeneidad y flexibilidad de los glicanos. Numerosos y exhaustivos trabajos en el campo de la glicómica han demostrado que es precisamente gracias a estas características la razón por la cual los glicanos han sido seleccionados, entre otras biomoléculas, como intermedios claves para los procesos celulares de proliferación, diferenciación, adhesión, infección, comunicación, etc. En esta tesis, hemos intentado estudiar en profundidad la estructura de los glicanos, con el objetivo de conciliar sus propiedades estructurales intrínsecas a nivel atómico, con los motivos de su flexibilidad molecular. Cuando los glicanos interaccionan con sus receptores, esta flexibilidad se une a la plasticidad del sistema global para dar al lugar al proceso de reconocimiento molecular. De hecho, las dos partes que participan en la interacción intermolecular pueden adaptar su superficie de contacto de manera que se maximice la entalpia de unión. De manera alternativa o complementaria, el glicano y el receptor podrían mantener movimientos moleculares internos, incluso en el estado unido, de tal manera que se minimizase la penalización entrópica del proceso de unión. Como consecuencia de ello, el papel de la compensación entálpico/entrópica no es fácil de evaluar ni de medir. A lo largo de esta tesis nos hemos enfocado en la interacción entre azúcares y proteínas, empezando por el estudio de la flexibilidad en los anillos de los monosacáridos, siguiendo por la investigación de los movimientos alrededor de los enlaces glicosidicos en disacáridos, para después pasar a la descripción cuantitativa de los movimientos macromoleculares internos de un receptor. Por último, se han discutido las interacciones intermoleculares de tipo CH/ que contribuyen a la estabilidad de los complejos de proteína-azúcar y se ha propuesto una nueva estrategia para su detección directa. Capítulo I. La introducción de esta tesis se ha centrado en el código de los carbohidratos, en cómo la información biológica se almacena en la estructura de los glicanos y cómo este mensaje es leído y traducido por sus receptores. También se discute el uso de glicomiméticos y su empleo como moléculas de interés bio-médico y espectroscópico. El capítulo concluye con una descripción de los métodos experimentales que se han empleado en esta tesis para elucidar la estructura y las interacciones de los glicanos.
Capítulo II. En este capítulo se discute la flexibilidad de los azúcares a nivel de monosacárido. Se presenta una nueva generación de glicomiméticos que contienen átomos de flúor. Hemos aplicado una combinación de espectroscopía de RMN y métodos computacionales para investigar el comportamiento dinámico de los anillos de idosa y glucosa. Más específicamente, se han utilizado experimentos de RMN a baja temperatura para ralentizar el intercambio conformacional en los anillos de idosa. En estas condiciones, el intercambio conformacional es lento en la escala de tiempos del desplazamiento químico de 19F, permitiendo así acceder a las características termodinámicas y cinéticas del equilibrio. Capítulo III De los monosacáridos a los disacáridos. En este capítulo se discute el origen de la flexibilidad del enlace glicosídico. En concreto, el uso de miméticos moleculares proporciona resultados clave en el diseño de glicanos sintéticos, y permite modular las componentes estereoelectrónicas relevantes para definir la distribución de poblaciones de los posibles confórmeros. Mediante el uso de métodos de RMN y de cálculos teóricos, se ha demostrado que es posible restablecer el efecto anomérico de un acetal cuando se sustituye uno de los átomos de oxígeno por un grupo CF2. Capítulo IV. Receptores de glicanos. La relación que existe entre la dinámica de las proteínas y sus funciones está todavía poco caracterizada desde el punto de vista energético. En este capítulo hemos utilizado GGBP, una proteína de unión a glucosa y galactosa, como modelo para definir los movimientos conformacionales asociados a su función, tanto desde el punto de vista estructural como energético. Para llevar a cabo este estudio hemos usado un enfoque innovador que combina los experimentos de RMN de compuestos paramagnéticos con simulaciones de Dinámica Molecular. Nuestros resultados demuestran que la proteína en su estado libre coexiste entre conformaciones abiertas y cerrada, con una velocidad de intercambio de 25 ns. A pesar de esta heterogeneidad conformacional, la presencia del ligando provee el ímpetu para desplazar el equilibrio hacia la forma cerrada. Estos resultados demuestran que, en algunos casos, el evento de reconocimiento molecular no se puede describir como un proceso puro de tipo “induced fit” o “conformational selection”. Capítulo V. Las interacciones tipo CH/& aportan importantes contribuciones a los procesos de reconocimiento molecular. En complejos de glicano-proteína, estas interacciones débiles implican un sistema & de un residuo aromático de la proteína, como aceptor, y un grupo polarizado CH en el azúcar, como donante. A pesar de su amplia presencia en complejos receptor-carbohidrato, caracterizada por estudios estructurales de Rayos X y de RMN, no existe evidencia experimental directa de esta interacción. Nosotros proponemos que la RMN podría proporcionar evidencias directas de la existencia de esta interación débil via una constante de acoplamiento escalar intermolecular J. En este capítulo se discuten los resultados preliminares dedicados al diseño de un sistema con etiquetas isotópicas apropiadas para mejorar la sensibilidad experimental necesaria para dicha detección directa. Capítulo VI. Aquí se presentan las conclusiones generales derivadas del trabajo que se ha realizado durante este programa de estudios de doctorado.
Descripción138 p.-46 fig.-16 tab.
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