Localización subcelular e interacciones moleculares de la proteína 2b del virus del mosaico del pepino: su relevancia en la función supresora de silenciamiento génico

Abstract

[EN] Gene silencing is an important resistance of plants against viruses that limits their accumulation and dispersión at the celular, local and systemic levels. Plant viruses have co-evolved proteins with suppression of RNA silencing functions that can interfer this defense at different points; some viral suppressors directly bind and sequester the small RNAs (sRNAs) that direct silencing to specific sequence targets, thus preventing their incorporation into the RNA-Induced Silencing Complexes (RISCs) and their degrading action on viral RNA targets of complementary sequence. Others interact with protein components of the silencing machinery inhibiting their functions or degrading them. In some other cases, the same suppressor can acts in both manners. Cucumber mosaic virus (CMV) is an RNA virus of cosmopolite distribution that causes important losses to agricultural and ornamental crops. Different phylogenetic clades have been established based on the sequence of the 2b gene that encodes the 2b protein: subgroups IA and IB cause severe symptoms in plants while those of subgroup II are less severe. The 2b protein has silencing suppressor activity and it is a known pathogenicity determinant in this virus. Prior to this work, several research groups had postulated that its suppression of silencing activity required nuclear localization (Lucy et al. 2000. EMBO 19, 1672), interaction with some argonaute proteins (AGO1: Zhang et al. 2006b. Genes & Dev. 20, 3255) or binding to sRNAs (Goto et al. 2007. Plant Cell Physiol. 48, 1050). The work presented in this PhD Thesis was aimed at contributing to determine the relative importance that for silencing suppression the nuclear subcellular localization and its interaction with host factors from the silencing machinery (AGO proteins or small RNAs of viral sequence RNAs) had in a 2b protein from a subgroup IA Fny-CMV strain. To pursue this objective we used different experimental approaches. One of them was to transiently express the 2b protein, either in its native or in modified forms in Nicotiana benthamiana plants through the agroinfiltration technique in order to visualize the subcellular localization in epidermal cells of protein fused to fluorescent tags in vivo, to perform co-localization studies with other plant proteins also tagged in order to fluoresce, or to visualize protein-protein interactions using the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technique, all in vivo. Crucially, a variant application of the agroinfiltration technique allows us also to evaluate the suppressor activities of each of our modified 2b protein constructs and thus compare them with that of the native protein. This allowed us to determine the effect of the different taggings or mutations we used in this work on the suppressor activities of the modified proteins, and to correlate our observations in vivo and in vitro with their biological activities.

We started characterizing the effects of fusions to fluorescent markers on the suppressor activities of the native 2b protein and of nine mutants affecting regions of the protein that previous works by others had described as relevant for diverse reasons. We visualized with these tagged constructs their subcellular localizations and using BiFC their interactions with proteins. On the other hand, the same nine mutants as well as the native protein were expressed in bacteria and purified to determine their abilities to bind to RNAs in vitro. By performing suppression assays on the silencing of the transient expression of a coexpressed GFP reporter we characterized the suppressor activities of each of our constructs. All mutant constructs that had no suppressor activities accumulated also poorly in agroinfiltrated tissue. However, when expressed in the presence of a heterologous P19 suppressor from tombusvirus they accumulated to normal levels, demonstrating that those mutations did not affect the stability of the protein and that their lack of suppressor activities were not caused by their deficient accumulation for that latter reason. These same silencing suppressor assays showed that native 2b protein fused at either termini to fluorescent or to other types of tags retained suppressor activity. This allowed us to study the subcellular distribution in vivo of biologically functional native protein and of the different mutants by tagging them to fluorescent markers (green fluorescent protein, GFP; monomeric red fluorescent protein, mRFP1), or to visualize interactions among proteins by BiFC also in vivo. GFP- and mRFP-tagged 2b protein localized throughout the cytoplasm and nucleus and within the latter in the nucleolus and cajal bodies (CBs). This is something that had not been described previously. With regard to the mutants, three mutants with deletions affecting the nuclear localization signals (NLSs) were found mainly in the cell cytoplasm whereas deletion of a putative phosphorylation domain confined the protein to the nucleolus. The remaining mutants presented a subcellular distribution similar to that of the native 2b protein. Addition of a nuclear export signal (NES) to the protein traslocated it to the cell cytoplasm, however, this did not affect its suppressor activity. This fact demonstrated that for displaying suppressor activity in the cell the 2b protein does not require its accumulation within the nucleus. In BiFC assays the 2b proteins fused to the amino- and carboxyl- splits of the yellow fluorescent protein interacted forming homodimers in the cytoplasm and the nucleus. All the mutants retained this property and also the ability to interact with proteins AGO1 in the cytoplasm and also AGO4 in the nucleus, excluding the nucleolus; and potentially to interact to the nuclear proteins coilin, fibrillarin and nucleolin in nuclear bodies which interaction could explain the nucleolar presence of the protein.

In in vitro assays the abilities of the native and mutant 2b proteins to bind to synthetic sRNAs of 21 nucleotides in length were characterized: to double-stranded siRNAs (ds siRNAs), to single-stranded siRNAs (ss siRNAs), or to a micro RNA (miRNA). The native protein was able to bind to the three RNAs at protein:RNA molar ratios of 2:1 with different affinities. The nine mutations analyzed affected these bindings differently, but overall it was found that those mutants without suppressor activities had their ability to bind those sRNAs altered, in most cases very reduced or altogether abolished. In particular no mutant without suppressor activity could bind to ds siRNAs at molar ratios that approached 2:1. Proteins with suppressor activities also binded to a long RNA (6,4 kb) but the molar ratios had no biological significance. Therefore, although the 2b protein of Fny CMV accumulates in the nucleus and within it in the nucleolus and CBs, its suppressor of RNA silencing activity does not require this nuclear accumulation, and appears to be done by cytoplasmic protein. From the study of the interactions of a battery of nine mutants with themselves and with AGO proteins in vivo or with sRNAs in vitro a correlation between suppressor activity and the abiility to bind to sRNAs at suppressor:RNA molar ratios of 2:1 appears, in particular with regard to the binding of ds siRNAs. This suggests that homodimers of the 2b protein interfere with antiviral silencing through the sequestering of ds siRNAs of viral sequence in the cytoplasm, without excluding other possible means of action.

[ES] El silenciamiento génico es una importante resistencia de las plantas frente a los virus que limita su acumulación y su dispersión a nivel celular, local y sistémico. Los virus vegetales han desarrollado proteínas con actividad supresora del silenciamiento de RNA que pueden interferir con esta defensa en diferentes puntos; algunos supresores virales unen y secuestran directamente los RNAs pequeños (small RNAS, sRNAs) que dirigen el silenciamiento hacia dianas específicas previniendo su incorporación a los complejos de silenciamiento inducido por RNA (RNA-induced silencing complex, RISCs) y su acción degradadora de RNAs virales de secuencia complementaria, mientras que otros interaccionan con componentes proteicos de la maquinaria de silenciamiento inhibiendo su función o degradándolos. En algunos casos un mismo supresor puede actuar de ambas maneras. El Virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV) es un virus de RNA ampliamente distribuido que causa importantes pérdidas en especies agrícolas y ornamentales. Se han diferenciado diferentes clados filogenéticos según la secuencia del gen 2b que codifica la proteína 2b: los subgrupos IA y IB causan síntomas severos en plantas mientras que en el subgrupo II son más leves. La proteína 2b tiene función supresora de silenciamiento y es un conocido determinante de patogenicidad de este virus. Con anterioridad a este trabajo varios grupos de investigación habían postulado que la actividad supresora de silenciamiento de esta proteína requería de su localización nuclear (Lucy et al. 2000. EMBO 19, 1672), de su interacción con determinadas proteínas argonauta (AGO1: Zhang et al. 2006b. Genes & Dev. 20, 3255) o de su unión a sRNAs (Goto et al. 2007. Plant Cell Physiol. 48, 1050). El trabajo que se presenta en esta tesis doctoral ha pretendido contribuir a determinar la importancia relativa que tienen en la supresión del silenciamiento antiviral la localización subcelular nuclear, y sus interacciones con factores de la maquinaria del silenciamiento antiviral (proteínas AGO o RNAs pequeños de secuencia viral) de la proteína 2b de la cepa Fny del subgrupo IA de CMV. Para perseguir los objetivos de esta tesis utilizamos diversas aproximaciones experimentales. Una de ellas fue expresar transitoriamente en plantas de Nicotiana benthamiana la proteína 2b, nativa o modificada, mediante la técnica de agroinfiltración para visualizar in vivo la localización subcelular en células epidérmicas de construcciones de proteína 2b fusionadas a marcadores fluorescentes, realizar estudios de colocalización con otras proteínas de la planta también marcadas para fluorescer, o visualizar in vivo interacciones proteína-proteína mediante la técnica de complementación bimolecular fluorescente (bimolecular fluorescence complementation, BiFC). Crucialmente, una variante de la técnica de agroinfiltración permite también evaluar la actividad supresora de cada una de nuestras construcciones modificadas y comparar así su actividad frente a la de la proteína nativa. Esto nos permitió determinar el efecto de los diferentes marcajes o mutaciones en la actividad supresora de las proteínas modificadas, y correlacionar nuestras observaciones in vivo e in vitro con sus actividades biológicas.

Caracterizamos primero el efecto de la fusión de marcadores fluorescentes en la actividad supresora de la proteína 2b nativa y en nueve mutantes afectando a regiones de la proteína que trabajos anteriores de otros grupos habían descrito como relevantes por diversas razones. Con estas construcciones visualizamos sus localizaciones subcelulares, y mediante BiFC interacciones con proteínas. Por otro lado los nueve mutantes y la proteína nativa se expresaron y purificaron en bacteria para determinar sus capacidades de unión in vitro a siRNAs. Mediante ensayos de supresión local del silenciamiento de un gen indicador GFP, por proteína 2b nativa o por varios mutantes, caracterizamos las actividades supresoras de cada uno ellos. Todos los mutantes sin actividad supresora se acumularon pobremente en el tejido infiltrado. Sin embargo, cuando se expresaron en presencia de un supresor heterólogo, P19 de tombusvirus, se acumularon a niveles normales, lo que demuestra que dichas mutaciones no afectaban a la estabilidad de la proteína y que su falta de actividad supresora no era debida a su deficiente acumulación por esa razón. Mediante los mismos ensayos de supresión de silenciamiento se observó que la proteína 2b nativa fusionada a diferentes marcadores fluorescentes y de otros tipos en de sus extremos amino o carboxilo retenía su actividad supresora de silenciamiento. Esto nos permitió estudiar la distribución subcelular in vivo de la proteína nativa y la de los diversos mutantes mediante su fusión a marcadores fluorescentes (proteína verde fluorescente, green fluorescent protein, GFP; o proteína monomérica roja fluorescente, monomeric red fluorescent protein, mRFP1), o visualizar interacciones entre proteínas mediante BiFC, también in vivo. La proteína 2b marcada con GFP se localizó en el citoplasma y núcleo, y dentro de éste en el nucléolo y cuerpos de cajal (cajal bodies, CBs), que hasta este trabajo no se había descrito. Los mutantes con delecciones en las señales de localización nuclear (nuclear localization signals, NLSs) sólo se encontraron en el citoplasma, mientras que la delección de un supuesto motivo de fosforilación confinó la proteína en el nucléolo. El resto de mutantes no presentaron alteración de la localización celular respecto a la de la proteína 2b. La adición de una señal de exportación nuclear (nuclear export signal, NES) a la proteína 2b la traslocó al citoplasma celular aunque esto no afectó a su actividad supresora, lo que demostró que para la actividad supresora la proteína 2b no necesita acumularse en el núcleo.

En ensayos de BiFC, las proteínas 2b fusionadas a las mitades amino y carboxilo de la proteína fluorescente amarilla interaccionaron formando homodímeros en citoplasma y nucléolo. Todos los mutantes retuvieron esta propiedad así como la de interaccionar con las proteínas AGO1 en el citoplasma y AGO4 en el núcleo, excluyendo el nucléolo, y potencialmente con las proteínas nucleares coilina, fibrilarina y nucleolina en cuerpos nucleares, cuyas interacciones tal vez podrían explicar su presencia en elnúcleo. En ensayos in vitro se caracterizaron las propiedades de unión de la proteína 2b a RNAs pequeños sintéticos de 21 nucleótidos: de doble hebra (double stranded siRNA, ds siRNA), de hebra sencilla (single stranded siRNA, ss siRNA), o un micro RNA (miRNA). La proteína 2b nativa unió los tres RNAs a ratios molares de proteína:RNA de 2:1 con diferentes afinidades. Las nueve mutaciones analizadas afectaron a estas uniones de manera diversa, pero se observó que aquellos mutantes sin actividad supresora tenían su capacidad de unión a estos RNAs pequeños alterada, en la mayor parte de los casos muy reducida o nula. En particular, ningún mutante sin actividad supresora unió ds siRNAs a ratios molares cercanos a 2:1. Las proteínas con actividad supresora unieron también un RNA largo (6,4 kb) aunque con una relación proteína:RNA sin significación biológica. Por lo tanto, aunque la proteína 2b de Fny CMV se acumula en el núcleo, y dentro de éste en el nucléolo y los CBs, su actividad supresora de silenciamiento de RNA no requiere de dicha acumulación nuclear, y parece realizarse por proteína citoplásmica. Del estudio de las interacciones de una batería de mutantes consigo mismas y con proteínas AGO in vivo o con RNAs pequeños in vitro se observa una correlación entre la actividad supresora y la capacidad de unir estos últimos ratios molares supresor:RNAb de 2:1, en particular ds siRNAs. Esto sugiere que homodímeros de la proteína 2b interfieren con el silenciamiento antiviral mediante el secuestro de ds siRNAs de secuencia viral en el citoplasma, sin excluir otras posibles formas de actuación.