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Título

Modificaciones postraduccionales de GTPasas endosomales implicaciones en localización y tráfico intracelular

AutorOeste, Clara L.
DirectorPérez-Sala, Dolores
Palabras claveEndosomal GTPases
GTPasas endosomales
Isorenylation and palmitoylation
Isoprenilación y palmitoilación
Multivesicular bodies
Cuerpos multivesiculares
Posttranslational modifications
Modificaciones postraduccionales
Fecha de publicación2015
EditorCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
Universidad Complutense de Madrid
Resumen[EN] Small GTPases of the Ras superfamily are key to cellular processes such as differentiation, proliferation or regulation of the cytoskeleton (Takai et al., 2001). These proteins undergo lipid modifications that elicit their attachment to membranes and are crucial to their activity. Specifically, Ras protein isoprenylation serves as an anchor to the membrane, and Ras proteins are further amenable to reversible palmitoylation, which contributes to their dynamic localization at distinct subcellular compartments (Hancock et al., 1989). Lipid modifications take place at cysteine residues in the Cterminal region. Furthermore, these cysteines can undergo oxidation or addition of electrophilic compounds, e.g. cyclopentenone prostaglandin binding. These compounds are formed by non-enzymatic oxidation of arachidonic acid or from dehydration of other prostaglandins, which endows them with electrophilic carbons (Funk, 2001). Rho proteins are a group of Ras superfamily proteins that are crucial to cell adhesion and migration, hence modulating cardiovascular pathophysiology and tumorigenic processes (Ridley, 2001). RhoB is a member of this family with roles invesicular trafficking, tumor suppression and localization of signaling proteins. RhoB lipid modifications (isoprenylation and double palmitoylation) are necessary for its localization to endolysosomes and its degradation through this pathway (Pérez-Sala et al., 2009; Stamatakis et al., 2002). The last eight amino acids of RhoB, which correspond to the lipidation motif, constitute an endolysosomal localization and degradation sequence for chimeric proteins to which this extension is added at their C-terminal end (Pérez-Sala et al., 2009).
In the context of this dissertation, in vitro and cell models have been used to study mechanistic and structural aspects of Ras and Rho protein modification, particularly that of RhoB, and its influence on localization and trafficking of these proteins or their chimeras modified by lipids and other compounds. Though lipid modifications of Ras proteins have been described as important regulatory factors, the involvement of lipidation and its interplay with other structural determinants in subcellular targeting of GTPases has not been fully elucidated. Therefore, the role of lipid modifications of RhoB cysteine residues and other important residues at the hypervariable region on its intracellular sorting has been analyzed. Furthermore, studies were carried out to determine whether the RhoB lipidation motif per se (CINCCKVL) is able to mimic the full-length protein. Cell models from different species were used to evaluate whether the latent sorting mechanisms for CINCCKVL proteins are conserved in these model organisms. Using this C-terminal construct in parallel to the full-length protein, the potential involvement of key molecular machineries, i.e. ESCRT complexes, CD63 or lipid dynamics, in their sorting was assessed. Considering the potential alteration of subcellular localization of Ras proteins by modification, targeting of lipidation sequences by other structurally diverse moieties, including reactive species arising in pathological scenarios, was also explored. In addition, assays were carried out to study the potential alteration of endosomal GTPase localization in genetic models of lysosomal disease.
In order to characterize the precise subcellular localization of RhoB, constructs of fluorescent proteins fused to this protein were compared to those of other small GTPases used as markers of endocytic vesicles. Co-localization with fusion proteins of Rab7, Rab9 or Lamp and negligible overlap with early endosome markers, i.e. Rab5 fusion proteins, or the Golgi marker, giantin, underscore RhoB localization within the endolysosomal lumen. These studies also include assays with autophagy probes, with which RhoB or its chimeras show negligible co-localization. The small GTPase, TC10, contains a C-terminal sequence that is very similar to that of RhoB, though a basic amino acid patch upstream of the lipidation sequence elicits retention at the limiting membrane of endolysosomes. Insertion of this basic patch into the RhoB sequence hinders its entry into endolysosomes, highlighting that exchange of structural determinants between these proteins elicits interconversion of their subcellular localization patterns. Furthermore, it has been determined that chimeras bearing the RhoB C-terminal sequence, CINCCKVL, are also internalized into endolysosomes. It was also described that chimeric proteins fused to the C-terminal sequence of RhoB (CINCCKVL) enter into the endolysosomal lumen. Therefore, studies were carried out to assess whether the CINCCKVL sequence can travel to endolysosomes in cells from diverse species, which in some cases lack an endogenous RhoB homolog sequence. The universality of endolysosomal localization of chimeras bearing the RhoB C-terminus was set forth by detection of these proteins in endolysosomes of cells as phylogenetically distant as amphibians, insects and fungi.
It has been previously described that RhoB is involved in diverse pathologies such as tumorigenic processes and cardiovascular malfunction (Prendergast, 2001). The results obtained showing RhoB localization to endolysosomal membranes warranted studies in models of lysosomal diseases such as Chediak-Higashi or Niemann-Pick. These disorders result in oculocutaneous albinism, immunodeficiency and cognitive impairment of varying degree (Huizing et al., 2008). Comparing RhoB to other endosomal GTPases in cells of patients suffering from these diseases, confocal laser microscopy shows that RhoB is localized to the dilated endolysosomes typical of these diseases. In many pathological scenarios, proteins suffer modifications due to alterations in overall cellular redox status. By means of electrophoretic assays (SDS-PAGE) or proteomic approaches (MALDI-TOF), it was shown that proteins of the Ras superfamily, particularly H-Ras and RhoB, could be modified in vitro at their Cterminal cysteine residues by structurally diverse electrophilic lipids. Specifically, dienone cyclopentenone prostaglandins, derived from non-enzymatic oxidation of arachidonic acid or dehydration of other prostaglandins, bind to these residues.
[ES] Las GTPasas de bajo peso molecular comprendidas en la superfamilia Ras son proteínas fundamentales para procesos celulares como la diferenciación celular, la regulación del citoesqueleto y la proliferación (Takai et al., 2001). Estas proteínas sufren modificaciones lipídicas que les permiten asociarse con las membranas celulares y son clave para su actividad. En concreto, las proteínas Ras están isopreniladas para anclarse a la membrana, además de ser susceptibles de palmitoilación reversible, lo cual contribuye a su localización dinámica en distintos compartimentos subcelulares (Hancock et al., 1989). Estas modificaciones lipídicas tienen lugar sobre residuos de cisteína en la región carboxilo-terminal (C-terminal). Además, estas cisteínas pueden sufrir oxidaciones o adición de compuestos de naturaleza electrofílica, como por ejemplo, la unión de prostaglandinas ciclopentenonas (Oeste and Pérez-Sala, 2014). Estos compuestos se forman por oxidación no enzimática del ácido araquidónico o por deshidratación de otras prostaglandinas, lo cual las dota de carbonos electrófilos (Funk, 2001). Las proteínas Rho juegan papeles cruciales en la adhesión y migración celular que repercuten sobre la fisiopatología cardiovascular y procesos tumorigénicos (Ridley, 2001). RhoB es un miembro de esta familia con funciones reguladoras del tráfico vesicular, la supresión de tumores y la localización de proteínas señalizadoras. Las modificaciones lipídicas de RhoB (isoprenilación y doble palmitoilación) son necesarias para su localización endolisosomal y posterior degradación por esta vía (Pérez-Sala et al., 2009; Stamatakis et al., 2002). Los últimos ocho amino ácidos de RhoB, zona donde se encuentran las cisteínas que se lipidan, comprenden una secuencia de localización y degradación endolisosomal para proteínas quiméricas a las que se les añade esta extensión en su extremo carboxilo-terminal (Pérez-Sala et al., 2009). En el contexto de esta tesis se han estudiado, tanto in vitro como en modelos celulares, aspectos mecanísticos y estructurales de la modificación de proteínas Ras y Rho, en concreto RhoB, y su repercusión sobre la localización y tráfico de estas proteínas o sus quimeras modificadas por lípidos y otros compuestos.
2. Objetivos: Las GTPasas de bajo peso molecular ejercen diversas funciones celulares desde localizaciones de membrana específicas. Entre los factores que las regulan, la modificación en secuencias C-terminales juegan un papel crucial, aunque la participación de la lipidación y su interacción con otros determinantes estructurales en la localización subcelular de las GTPasas no ha sido completamente dilucidado. Por ello, el trabajo presentado en esta tesis se centra en analizar el papel de las modificaciones lipídicas en residuos de cisteína de RhoB sobre su tráfico intracelular y determinar si el motivo de lipidación per se es capaz de reproducir el comportamiento de la proteína completa. Además, la posibilidad de que las secuencias de lipidación puedan ser dianas de modificación por otros compuestos de estructura diversa, incluidas especies reactivas que se producen en situaciones patológicas, no se ha explorado. Por tanto, los siguientes objetivos fueron planteados: ! Estudiar el papel de las secuencias C-terminales de GTPasas endosomales en su localización subcelular. ! Valorar la importancia de la isoprenilación y la palmitoilación en la asociación de estas proteínas a vesículas intracelulares. ! Determinar la localización subcelular de quimeras que contienen la secuencia de lipidación del C-terminal de RhoB. ! Evaluar si los mecanismos latentes de localización del C-terminal de RhoB están conservados en células de diversas especies. ! Explorar el posible rol de maquinarias moleculares clave, tales como los complejos ESCRT, CD63 o la dinámica lipídica, en la localización de RhoB y quimeras relacionadas. ! Asentar las bases para estudiar posibles alteraciones en la localización y modificación de GTPasas endosomales en modelos experimentales de enfermedad.
3. Resultados: Se ha llevado a cabo una caracterización de RhoB fusionada a proteínas fluorescentes en el contexto de las endomembranas al comparar su localización y degradación con las de otras GTPasas pequeñas. Su colocalización con proteínas fluorescentes fusionadas a Rab7, Rab9 o Lamp y falta de coincidencia con marcadores de endosomas tempranos (GFP-Rab5) o aparato de Golgi (giantin) atestiguan su localización en el lumen endolisosomal. Los estudios aquí presentados incluyen también la utilización de sondas de la vía autofagocítica, con las cuales ni RhoB ni sus proteínas quimera colocalizan de forma detectable. La GTPasa de bajo peso molecular, TC10, cuya secuencia C-terminal es muy similar a la de RhoB, contiene unos amino ácidos básicos que sin embargo la retienen en la membrana limitante de dichas vesículas. La inserción de la secuencia polibásica de TC10 en la secuencia de RhoB impide su entrada a endolisosomas, lo cual pone de manifiesto que hay determinantes estructurales que al intercambiarse entre estas proteínas dan lugar a patrones subcelulares específicos. Se describió además que las proteínas quimera fusionadas a la secuencia Cterminal de RhoB (CINCCKVL) también acceden al lumen endolisosomal. Por lo tanto, se exploró si la secuencia CINCCKVL accede a los endolisosomas no sólo en células de mamíferos, sino en células de organismos que pueden contener o no una secuencia endógena para proteínas homólogas a RhoB. La universalidad de la localización endolisosomal de quimeras con el C-terminal de RhoB se pone de manifiesto al detectarse en endolisosomas de células de organismos muy alejados entre sí en la escala filogenética, tales como anfibios, insectos y hongos.
Para explorar los posibles mecanismos de localización de RhoB, se emplearon técnicas de microscopía láser avanzada confocal y de superresolución. Por medio de estas potentes herramientas se ha podido establecer la localización inequívoca de RhoB y quimeras CINCCKVL en vesículas intraluminales de cuerpos multivesiculares. Se transfectaron células con RNA de interferencia para así silenciar componentes de la maquinaria ESCRT, responsable del tráfico endolisosomal y la formación de cuerpos multivesiculares (Raiborg and Stenmark, 2009). Al bloquear la función de algunos de estos componentes, RhoB no se internaliza en los endolisosomas, lo cual refleja un posible papel de las proteínas ESCRT en el tráfico endosomal de RhoB. Sin embargo, las quimeras CINCCKVL no se ven igualmente afectadas por el bloqueo de componentes ESCRT. Se estudiaron pues otros componentes proteicos y lipídicos de los cuerpos multivesiculares que podrían jugar también un papel en la localización de proteínas CINCCKVL, como por ejemplo la tetraspanina CD63. Esta proteína presenta una alta colocalización con RhoB y quimeras relacionadas en cuerpos multivesiculares. Curiosamente, se observó que la sobreexpresión de construcciones fluorescentes de CD63 cambian el patrón de localización subcelular de quimeras CINCCKVL, posiblemente hacia destinos extracelulares, pero no así el de RhoB. Para explorar el papel de la dinámica lipídica en la localización de estas proteínas, se realizaron ensayos de tratamiento celular con compuestos que alteran la dinámica de colesterol en las membranas. En estas células, se redujo la internalización de quimeras del C-terminal de RhoB hacia el lumen de cuerpos multivesiculares, mientras que la proteína completa siguió su camino hacia el interior de estos compartimentos. Además, el tratamiento con ceramida indujo cambios en la morfología celular que afectan la localización de RhoB y proteínas relacionadas. En conjunto, estos resultados sugieren que las quimeras CINCCKVL pueden seguir un destino subcelular mediado por maquinarias distintas a las responsables del transporte de RhoB completa, lo cual sugiere que RhoB contiene determinantes estructurales de localización o interacción más allá de los que aparecen en su secuencia de lipidación.
Descripción173 p.-53 fig.-4 tab.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/150119
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