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Título

Diseño e ingeniería de lacasas quiméricas por evolución dirigida para el tratamiento de biomasa vegetal

AutorPardo, Isabel
DirectorCamarero, Susana
Palabras claveLacasas
Evolución dirigida
Biomasa vegetal
Fenoles
Lignina
Fecha de publicación2016
EditorCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
Universidad Complutense de Madrid
Resumen[EN] Laccases are multicopper oxidases widely distributed in nature although the main producers of these enzymes are the white-wood rot basidiomycete fungi, the only organisms capable of completely degrading lignin. Laccases catalyze the oxidation of a large variety of aromatic compounds coupled to the reduction of oxygen to water. In addition, their catalytic capacities can be enhanced in the presence of redox mediators, low molecular weight compounds that, once oxidized by laccase, can oxidize other compounds that originally are not substrates of the enzyme. Due to their wide substrate range and their low catalytic requirements, laccases and laccase-mediator systems have a huge biotechnological potential, especially in processes of plant biomass treatment such as the production of paper and pulp or second generation biofuels. Also, these processes generate great amounts of residues enriched with lignin derived phenols that can act as laccase mediators, and their application could help reduce the process’s costs and environmental impact. However, for the industrial application of laccases, one may need to adjust their catalytic properties to the operation conditions by protein engineering. Previous works have described the directed evolution of two high-redox potential laccases from the basidiomycetes PM1 (PM1L) and Pycnoporus cinnabarinus (PcL). The evolved variants of these laccases, OB1 and 3PO, respectively, are the departure point for this doctoral thesis. The main goal for this doctoral thesis was to engineer high-redox potential laccases by directed evolution techniques for their possible application in plant biomass treatment. To this end, we established three major tasks: i. To obtain chimeric laccases from the evolved variants of PM1L (OB1) and PcL (3PO), in order to combine and/or enhance their properties of interest and to obtain information on the structural determinants for the activity and stability of these enzymes. ii. To develop new laccase activity assays in high-throughput screening (HTS) format in order to explore the mutant libraries generated by directed evolution. iii. To enhance laccase activity over lignin-derived phenolic mediators by the semi-rational design of the substrate binding pocket.
First, we applied a random chimeragenesis strategy that combined the in vitro and in vivo DNA shuffling (CLERY) of OB1 and 3PO genes, selecting those mutants that presented higher activity. The exchanged sequence segments gave way to 3–31 amino acid substitutions in the mature laccase sequences. Among the chimeric laccases obtained, we observed shifted pH activity profiles respecting parent types, and some were also more thermostable. From the battery of generated chimeras, we chose five as possible departure points for future directed evolution studies. With the aim to obtain variants with a higher number of mutations, we constructed two new laccases by exchanging the second cupredoxin domain between OB1 and 3PO. The two new chimeras presented 65 amino acid substitutions each. One of them presented a shifted pH activity profile, while the other presented an important increase of stability towards temperature, pH and solvents. 3.2. Development of new high-throughput screening methods We developed several HTS methods to analyze laccase mutant libraries generated by directed evolution. First of all, we designed three assays based on the oxidation of syringyl-type phenols derived from lignin that act as laccase mediators (sinapic acid, syringaldehyde and acetosyringone). Second, we developed an assay specific for high-redox potential laccases based on the oxidation of the synthetic mediator violuric acid, so as to assure that the enzyme’s redox potential was not affected during directed evolution. Finally, we designed three assays based on the oxidation of azoic (Evans Blue and Methyl Orange) and anthraquinoid (Remazol Brilliant Blue) synthetic dyes, which are the group of dyes most used in the textile industry and whose biodegradation would be of interest for effluent treatment. 3.3. Semi-rational design of the substrate binding pocket Taking one of the chimeric laccase obtained by CLERY as departure point, we performed iterative saturation mutagenesis (ISM) over six residues from the substrate binding pocket in order to enhance its activity over phenolic compounds of interest. We used the sinapic acid HTS assay developed in this thesis for the exploration of the mutant libraries. Of all the mutants obtained, two were selected for their biochemical characterization. The new laccase variants presented shifted pH activity profiles towards more neutral values and higher reaction constants than parent type towards sinapic acid and methyl sinapate, although their activity towards other syringyl-type phenols was not significantly enhanced. With the purpose of rationalizing the effect of the mutations in the ISM variants, we performed PELE and QM/MM computational simulations. These revealed that the mutations introduced allowed a new binding mode of sinapic acid that favored a more efficient electron transfer to the laccase’s catalytic copper. Finally, we also evaluated the oxidation of other lignin derived phenols by different ISM mutants, in order to find whether any of them presented increased activity towards other substrates different than sinapic acid. Some of them were able to better oxidize guaiacyl-type phenols and other compounds of interest such as resveratrol.
Using different chimeragenesis techniques, we have obtained new high-redox potential laccases with better properties than both parent types. One of this chimeras, more stable and with better activity over phenols, was used as departure point in order enhance the oxidation of sinapic acid by applying semi-rational design strategies and HTS assays developed ad hoc. On the other hand, computational simulations have provided valuable information on the structural factors that determine the efficient oxidation of substrate by laccase.
[ES] Las lacasas son oxidasas multicobre que se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza aunque los principales productores de estas enzimas son los hongos basidiomicetos de la podredumbre blanca de la madera, los únicos organismos capaces de degradar completamente la lignina. Las lacasas catalizan la oxidación de una gran variedad de compuestos aromáticos acoplada a la reducción de oxígeno a agua. Además, su capacidad catalítica puede ampliarse en presencia de mediadores redox, compuestos de bajo peso molecular que, una vez oxidados por la lacasa, pueden oxidar otros compuestos que en principio no son sustrato de la enzima. Debido a su amplio rango de sustratos y a sus bajos requerimientos catalíticos, las lacasas y los sistemas lacasa-mediador tienen un gran potencial biotecnológico, particularmente en procesos de tratamiento de la biomasa vegetal como son la producción de pasta de papel o de biocombustibles de segunda generación. Además, en estos procesos se genera una gran cantidad de residuos ricos en fenoles derivados de la lignina que pueden actuar como mediadores de lacasa, y cuyo uso podría reducir los costes y el impacto medioambiental del proceso. Sin embargo, para la aplicación industrial de las lacasas puede ser necesario recurrir a la ingeniería de proteínas para ajustar sus propiedades catalíticas a las condiciones de operación. En trabajos previos se ha descrito la evolución dirigida de dos lacasas de alto potencial redox procedentes de los basidiomicetos PM1 (PM1L) y Pycnoporus cinnabarinus (PcL). Las variantes evolucionadas de estas lacasas, OB1 y 3PO, respectivamente, son el punto de partida de esta tesis doctoral.
El objetivo general de esta tesis doctoral fue la ingeniería de lacasas de alto potencial redox mediante técnicas de evolución dirigida para su posible aplicación en el tratamiento de la biomasa vegetal. Para ello, se plantearon tres grandes tareas: i. Obtener lacasas quiméricas a partir de las variantes evolucionadas de PM1L (OB1) y PcL (3PO), con el fin de combinar y/o mejorar sus propiedades de interés y obtener información sobre los determinantes estructurales de la actividad y estabilidad de estas enzimas. ii. Desarrollar nuevos ensayos de determinación de actividad lacasa en formato de high-throughput screening (HTS) para la exploración de las librerías de mutantes generadas por evolución dirigida. iii. Mejorar la actividad lacasa sobre mediadores fenólicos derivados de la lignina mediante el diseño semi-racional del bolsillo de unión a sustrato. 3. Resultados 3.1. Obtención de lacasas quiméricas. En primer lugar se empleó una estrategia de quimeragénesis al azar mediante la combinación del barajado in vitro e in vivo (CLERY) de los genes de OB1 y 3PO, seleccionando aquellos mutantes que presentaban mayor actividad. Los segmentos de secuencia intercambiados dieron lugar a la introducción de 3–31 sustituciones aminoacídicas en las secuencias de las lacasas maduras. Entre las lacasas quiméricas obtenidas se observaron perfiles de pH óptimo desplazados respecto a los de ambos parentales, y algunas resultaron ser también más termoestables. De la batería de quimeras generadas, se seleccionaron cinco como posibles puntos de partida para estudios posteriores de evolución dirigida. Con el fin de obtener variantes con un mayor número de mutaciones, se construyeron nuevas lacasas mediante el intercambio del segundo dominio cupredoxina entre OB1 y 3PO. Las dos nuevas quimeras adqurieron 65 sustituciones aminoacídicas cada una. Una de ellas mostró un perfil de pH óptimo desplazado, mientras que la otra presentó un importante incremento de estabilidad a temperatura, pH y solventes. 3.2. Desarrollo de nuevos métodos de high-troughput screening Se desarrollaron varios métodos de HTS para analizar librerías de mutantes de lacasa generadas por evolución dirigida. En primer lugar, se diseñaron tres ensayos basados en la oxidación de fenoles derivados de la lignina de tipo siringilo que actúan como mediadores de lacasa (ácido sinápico, siringaldehído y acetosiringona). En segundo lugar, se desarrolló un ensayo específico para lacasas de alto potencial redox basado en la oxidación del mediador sintético ácido violúrico, con el fin de asegurar que el potencial redox de la enzima no se veía afectado durante la evolución dirigida. Por último, se diseñaron tres ensayos basados en la oxidación de colorantes sintéticos de tipo azoico (azul de Evans y naranja de metilo) y antraquinoide (azul brillante de remazol), los tipos de colorantes más empleados en la industria textil y cuya biodegradación sería de interés para el tratamiento de efluentes. 3.3. Diseño semi-racional del bolsillo de unión a sustrato Utilizando como punto de partida una de las lacasas quiméricas obtenidas por CLERY, se realizó mutagénesis saturada iterativa (ISM) sobre seis residuos del bolsillo de unión a sustrato con el fin de mejorar su actividad sobre compuestos fenólicos de interés. Para la exploración de las librerías de mutantes se empleó el ensayo de HTS con ácido sinápico desarrollado en esta tesis. De los mutantes obtenidos, se seleccionaron dos para su caracterización bioquímica.
Las nuevas variantes de lacasa presentaron perfiles de pH óptimo desplazados hacia valores más neutros y constantes de reacción mayores que el parental para el ácido sinápico y el sinapato de metilo, si bien su actividad hacia otros fenoles de tipo siringilo no mejoró significativamente. Con el fin de racionalizar el efecto de las mutaciones en las variantes de ISM, se realizaron simulaciones computacionales de PELE y QM/MM. Éstas revelaron que las mutaciones introducidas permitían un nuevo modo de unión del ácido sinápico que favorecía una transferencia electrónica más eficiente al cobre catalítico de la lacasa. Por último, también se evaluó la oxidación de otros fenoles derivados de la lignina por parte de otros mutantes obtenidos por ISM, con el objetivo de encontrar si alguno mejoraba su actividad hacia otros sustratos distintos del ácido sinápico. Entre ellos, se encontraron algunos que oxidaban mejor fenoles de tipo guayacilo y otros compuestos de interés como el resveratrol. 4. Conclusiones: Empleando distintas técnicas de quimeragénesis se han obtenido nuevas lacasas de alto potencial redox con propiedades mejoradas respecto a ambos parentales. Una de estas quimeras, más estable y con mayor actividad sobre fenoles, ha servido como punto de partida para mejorar la oxidación del ácido sinápico, empleando estrategias de diseño semi-racional y ensayos de HTS desarrollados ad hoc. Por otro lado, el uso de simulaciones computacionales ha aportado valiosa información sobre los factores estructurales que determinan la oxidación eficiente del sustrato por las lacasas.
Descripción205 p.-64 fig.-18 tab.-anexo
URIhttp://hdl.handle.net/10261/149955
Aparece en las colecciones: (CIB) Tesis
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