Nuevas oxidorreductasas GMC de basidiomicetos ligninolíticos: Screening genómico, mecanismo catalítico y potencial biotecnológico

Abstract

[EN] The superfamily of glucose-methanol-choline oxidases/dehydrogenases (GMC) is composed of FAD-containing, phylogenetically-related proteins that share a common fold subdivided into two different domains: the FAD-binding and substrate-binding ones. Some fungal oxidoreductases belonging to the superfamily play a role as auxiliary enzymes in the lignocellulose-degrading process. Most of them are extracellular oxidoreductases that produce the H2O2 required: (i) by high redox potential peroxidases to act on lignin; or (ii) to trigger Fenton reactions, which give rise to radical oxygen species that attack lignocellulose. Investigation of the genomes of 10 selected Polyporales fungi, the only organisms able to completely mineralize lignin, shed light on the involvement of 5 families of GMC oxidoreductases in the lignocellulose decay. These were glucose oxidases (GOX), cellobiose dehydrogenases (CDH), pyranose 2-oxidases (P2O), methanol oxidases (MOX) and aryl-alcohol oxidases (AAO). Phylogenetic studies suggest that they share a common ancestor whose diversification took place at a more ancestral stage of fungal evolution, which is characterized by a low number of these GMC genes. AAO and MOX proved to be the most abundant GMC oxidoreductases present in the selected genomes. The number of genes encoding for these enzymes varies from one genome to another according to the ecophysiology of the fungi. In fact, brown-rot fungi, which do not mineralize lignin but alter its structure to gain access to carbohydrates, lost most of their lignin-degrading enzymes and GMC repertoire, except MOX. These fungi cause the demethoxylation of lignin that releases methanol and relies on the reactivity of radical oxygen species stemming from H2O2. These findings point out the coevolution of these fungal GMC enzymes with the lignin-degrading peroxidases.

which the reduction acts as the limiting step of the overall catalysis, in some variants neither of the half reactions was rate limiting. Affinity studies, as well as the rate constants estimated for the formation and dissociation of the enzyme product complex using a product analog, suggested the involvement of residue Phe397 in the product release from the active site. Furthermore, substitution of Phe397 with non-aromatic residues resulted in a decrease in the oxidation constants. The temperature dependence of AAO catalysis was studied with the aim of elucidating the involvement of the mechano-quantical effect known as hydrogen tunneling in the hydride transfer taking place during the reductive half-reaction of the enzyme. Data drawn from steady-state and rapid kinetics with protiated and deuterated substrates indicate that the tunneling effect is actually involved in the said transfer. Moreover, comparison of kinetic data for native AAO and mutated variants of residue Tyr92 suggests that the transfer depends on thermally-activated protein motions that enable the enzyme to transfer the particle from an already pre-formed, highly organized, enzyme-substrate configuration. These results are reinforced by the crystallographic structure resolved for the AAO:p-anisic acid complex, the final product of the 4-electron oxidation of p-methoxybenzyl alcohol.

The mechanisms lying behind the reoxidation of the enzyme and concomitant production of H2O2 had not been extensively characterized. Therefore, they were studied by rapid kinetics using solvent and substrate kinetic isotope effects. These investigations revealed that, after the initial and obligate electron transfer to overcome the spin inversion barrier, the enzyme transfers one hydrogen atom from FAD and one proton from a solvent exchangeable site in two separate kinetic steps, which are, thus, non-concerted. The solvent isotope effect that revealed this feature was negligible at acidic pH and appeared as a consequence of the combination of the lower proton availability at basic pH and the use of a deuterated solvent that slowed down the reaction. Finally, the biotechnological application of GMC oxidases was assessed for the production of 2,5-furandicarboxylic acid (FDCA), which can be polymerized with ethylene glycol to produce renewable bioplastics. AAO from P. eryngii demonstrated to be capable of catalyzing the oxidation of precursors of FDCA that are derived from the dehydration of fructose present in plant biomass such as 5- hydroxymethylfurfural (HMF). In spite of its activity on HMF and some partially oxidized derivatives, AAO alone was not able to convert them into FDCA. Such inability was solved by the combined action of unspecific peroxygenase (UPO) from the fungus Agrocybe aegerita, which was able to overcome the AAO limitations at expenses of the H2O2 generated by it. The synergistic activity of these two enzymes allowed the operation of an enzymatic cascade for the production of FDCA from HMF. AAO and UPO converted 90% of initial HMF into FDCA with the only net consumption of atmospheric O2.

[ES] La superfamilia de glucosa-metanol-colina oxidasas/deshidrogenasas (GMC) se compone de proteínas que contienen FAD que están filogenéticamente relacionadas entre sí y comparten un plegamiento común que se subdivide en dos dominios diferentes: el de unión a FAD y el de unión a sustrato. Algunas oxidorreductasas fúngicas que pertenecen a esta superfamilia desempeñan la función de enzimas auxiliares en el proceso de degradación de la lignocelulosa. La mayor parte de ellas son oxidorreductasas extracelulares que producen el H2O2 requerido: (i) por las peroxidasas de alto potencial redox para actuar sobre la lignina; o (ii) para desencadenar las reaciones de Fenton, que dan lugar a especies radicales de oxígeno que atacan a la lignocelulosa. El estudio de los genomas de 10 hongos seleccionados del orden Poliporales, los únicos organismos capaces de mineralizar totalmente la lignina, arrojó luz sobre la participación de 5 familias de oxidorreductasas GMC en la descomposición de la lignocelulosa. Estas fueron las glucosa oxidasas (GOX), celobiosa deshidrogenasas (CDH), piranosa 2-oxidasas (P2O), metanol oxidasas (MOX) y aril-alcohol oxidasas (AAO). Los estudios filogenéticos sugieren que estas enzimas comparten un ancestro común cuya diversificación tuvo lugar en una etapa más temprana de la evolución fúngica, que se caracterizó por el escaso número de estos genes GMC. Las AAO y las MOX resultaron ser las oxidorreductasas GMC más abundantes en los genomas seleccionados.

El número de genes que codifican para estas proteínas varía ampliamente de un genoma a otro de acuerdo con las características ecofisiológicas de cada hongo. De hecho, los hongos de podredumbre parda, que no mineralizan la lignina, sino que alteran su estructura con el fin de acceder a los carbohidratos embebidos en esta, perdieron la mayor parte del repertorio de enzimas GMC, con excepción de las MOX. Estos hongos causan la demetoxilación de la lignina, que libera metanol y depende de la reactividad de las especies radicales de oxígeno que se originan del H2O2. Estos hallazgos indican la coevolución de la enzimas GMC fúngicas con las peroxidasas degradadoras de la lignina. La AAO del basidiomiceto Pleurotus eryngii fue seleccionada como modelo representativo de la superfamilia GMC para ser estudiada desde el punto de vista mecanístico. Se trata de una enzima que cataliza: (i) la deshidrogenación oxidativa de alcoholes aromáticos produciendo los correspondientes aldehídos y (ii) la reducción de O2 a H2O2 en dos semirreacciones separadas. La semirreacción de reducción consiste en las abstracciones del hidrógeno en posición pro-R del carbono α del substrato alcohol en forma de hidruro por el FAD y la del protón del grupo hidroxilo por la His502 catalítica. Durante la semirreacción de oxidación estas partículas son finalmente transferidas al O2 reduciéndolo. El papel que el residuo Phe397 desempeña en la catálisis de la AAO se estudió mediante la comparación de las cinéticas tanto de estado estacionario como transitorio entre la enzima nativa y variantes mutadas para este residuo. Los resultados sugieren que la Phe397 está involucrada en ayudar al sustrato a entrar y acomodarse en el centro activo, así como en la salida del producto aldehído. Además, los estudios de afinidad llevados a cabo, así como las constantes cinéticas estimadas para la formación y disociación del complejo enzimaproducto empleando un análogo del mismo, avalan esta hipótesis.

La dependencia de la temperatura de la catálisis de AAO se estudió con el objetivo de dilucidar la participación del efecto mecano-cuántico conocido como tunneling de hidrógeno en la transferencia del hidruro durante la semirreacción de reducción de la enzima. Los datos obtenidos de las cinéticas en estado estacionario así como de las cinéticas rápidas con sustratos protiados y deuterados indican que el efecto túnel está involucrado en la mencionada transferencia. Además, la comparación de los datos cinéticos de la AAO salvaje con los de variantes mutadas del residuo Tyr92 sugieren que la transferencia depende de los movimientos proteicos activados térmicamente que permiten a la enzima transferir la partícula desde una configuración altamente organizada que se forma antes de la catálisis. Estos resultados se ven reforzados por la resolución de la estructura cristalográfica AAO:ácido p-anísico, el producto de la oxidación del alcohol p-metoxibencílico por 4 electrones. Los mecanismos que subyacen a la reoxidación de la enzima y la producción de H2O2 no se habían caracterizado en detalle. Por ello, estos procesos se estudiaron mediante cinéticas rápidas empleando efectos isotópicos de sustrato y solvente. Esta investigación reveló que, tras la transferencia obligada inicial de un electrón para superar la barrera de inversión de spin, la enzima transfiere al O2 un átomo de hidrógeno desde el FAD y un protón desde un lugar de intercambio con solvente en dos procesos químicos independientes, que son, por tanto, no concertados. El efecto cinético isotópico de solvente que desveló esto es despreciable a pH ácido y se hizo evidente como consecuencia de la combinación de la baja disponibilidad de protones a pH básico y el uso de solvente deuterado, que ralentiza la reacción. Finalmente, la aplicación biotecnológica potencial de oxidasas GMC se evaluó para la producción de ácido 2,5-furandicarboxílico (FDCA), que puede ser polimerizado con etilenglicol con el fin de obtener bioplásticos. La AAO de P. eryngii demostró ser capaz de catalizar la oxidación de precursores del FDCA que provienen de la deshidratación de la fructosa presente en la biomasa vegetal tales como 5-hidroximetilfurfural (HMF). A pesar de su actividad sobre HMF y algunos de sus derivados parcialmente oxidados, la AAO por sí sola no fue capaz de producir FDCA. Esto fue solventado por la acción combinada de una peroxigenasa inespecífica (UPO) del hongo Agrocybe aegerita, que fue capaz de catalizar las reacciones necesarias a expensas del H2O2 generado por la AAO. La acción sinérgica de estas dos enzimas permitió el establecimiento de una cascada enzimática para la producción del FDCA a partir de HMF. AAO y UPO convirtieron un 90% del HMF inicial en FDCA con el único consumo neto de O2 atmosférico.