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Title

Papel de riam en la invasión y en la dinámica de las adhesiones focales de las células de melanoma

AuthorsHernández-Varas, Pablo
AdvisorTeixidó, Joaquín
KeywordsMelanoma
Adhesión Celular
Señalización celular
Integrinas
Issue Date2011
PublisherCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)
Universidad Complutense de Madrid
Abstract[EN] RIAM, a member of the MRL (Mig‐10/RIAM/Lamellipodin) family, interacts with active Rap1, a small GTPase which is frequently activated in tumors such as melanoma and prostate cancer. In this thesis project, we show that RIAM is expressed in metastatic human melanoma and in melanoma cell lines, and that both RIAM and Rap1 are required for melanoma cell invasion. RIAM expression conferred growth and metastatic advantages to highly invasive human BLM melanoma cells using a SCID xenograft model. Our results indicate that defective invasion of RIAM‐silenced melanoma cells might arise from an impairment in persistent cell migration directionality, which was associated with deficient activation of the Vav2‐RhoA‐MLC pathway. Expression of constitutively active Vav2 and RhoA in cells depleted for RIAM partially rescue their invasion, indicating that Vav2 and RhoA mediate RIAM function. These results suggest that inhibition of cell invasion in RIAM‐silenced melanoma cells is likely based on altered cell contractility and cell polarization. Furthermore, we show that RIAM depletion reduces β1 integrin activation and β1‐dependent melanoma cell adhesion. The decreased adhesion correlated with deficient activation of both Erk1/2 MAP kinase and phosphatidylinositol 3‐kinase, two central molecules controlling cell growth and cell survival. The data suggest that defective activation of these kinases in RIAMsilenced cells might play a role in the inhibition of melanoma cell growth. Altogether, these results suggest that RIAM might contribute to the dissemination of melanoma cells. Due to the presence of RIAM at the focal adhesions, we investigated in this work its implication in the dynamic turn‐over of the focal adhesions, an essential process contributing to cell migration. Our results show that RIAM‐silenced BLM cells have an increased number of focal adhesions distributed over the central cell surface. Experiments conducted using nocodazol and FRAP analysis revealed that these cells have a deficiency in the focal adhesions dissasembly. The defective focal adhesion turn‐over correlated with increased levels of FAK and paxillin tyrosine phosphorylation. This fact may be due to an unproper recruitment of these proteins at the adhesions caused by an inhibited focal adhesion‐dissasembly, or on the other hand, might be a direct cause of this defect. Moreover, MEK‐Erk1/2‐mediated signaling is involved in the regulation of RIAM‐dependent adhesion dissasembly. Constitutively active MEK expression rescued the RIAM‐KD cells phenotype, decreasing both the number of centrally located focal adhesions and tyrosine phosphorylation levels of FAK and paxillin proteins. Our data suggest that RhoA could also be related to the adhesion dissasembly, as expression of constitutively active RhoA partially rescued the RIAM KD cell phenotype. In conclusion, these data indicate that RIAM is required for the focal adhesion dissasembly in melanoma cells, contributing to their turn‐over and to the proper phosphorylation of components such as FAK and paxillin. Furthermore, the defective invasion showed by RIAM KD cells could also be caused by these alterations in the focal adhesions turn‐over.
[ES] RIAM, un miembro de la familia MRL (Mig‐10/RIAM/Lamellipodin), interacciona con Rap1 activo, una pequeña GTPasa que se encuentra frecuentemente activada en tumores tales como el melanoma y el cáncer de próstata. En esta tesis demostramos que RIAM se expresa en muestras de melanoma metastático humano y en líneas celulares de melanoma, y que tanto RIAM como Rap1 son requeridas para la invasión de estas células. Asimismo, mostramos que la expresión de RIAM confiere ventajas en el crecimiento y la metástasis a las células de melanoma BLM, altamente invasiva, como pudo observarse en modelos de xenografting en ratones SCID. Nuestros resultados indican que la invasión defectuosa de las células silenciadas para RIAM es debido a un mantenimiento deficiente de la direccionalidad durante la migración celular, lo cual está asociado con la activación deficiente de la vía Vav2‐RhoA‐MLC en estas células. La expresión de formas constitutivamente activas de Vav2 y RhoA en las células deplecionadas para RIAM se tradujo en la recuperación parcial de la invasión celular, lo que indica que tanto Vav2 como RhoA contribuyen a esta invasión dependiente de RIAM. Adicionalmente, los datos sugieren que la inhibición de la invasión mostrada por estas células puede ser debida a una contractilidad y a una polarización celular deficientes. Por otra parte, mostramos que el silenciamiento de RIAM se traduce en una reducción de la adhesión celular dependiente de la integrina β1, lo cual se correlacionó con una activación deficiente tanto de Erk1/2 como de la fosfatidil‐inositol‐3‐quinasa, dos moléculas centrales en el control del crecimiento y la supervivencia celulares. En conjunto, estos datos sugieren que RIAM podría contribuir a la proliferación y a la diseminación de las células de melanoma. Dado que RIAM es una proteína presente en las adhesiones focales, en el presente trabajo estudiamos si podría regular la dinámica de renovación de las adhesiones focales, un proceso fundamental para la migración celular. Nuestros resultados mostraron que las células BLM silenciadas para RIAM tienen incrementado el número de adhesiones focales distribuidas en la parte central de la superficie celular. Experimentos llevados a cabo con nocodazol y análisis mediante FRAP revelaron que estas células tienen un desensamblaje defectuoso de las adhesiones focales. El defecto en la renovación de las adhesiones focales correlacionó con niveles incrementados de fosforilación en residuos de tirosina de FAK y paxilina. Esto podría deberse a un mantenimiento anómalo de estas proteínas en las adhesiones focales al encontrarse inhibido su desensamblaje, o ser la causa directa de dicho defecto. Asimismo, hemos observado que la señalización mediada por MEK‐Erk1/2 está implicada en la regulación del desensamblaje de las adhesiones mediado por RIAM. Así, la expresión de formas constitutivamente activas de MEK en las células deplecionadas para RIAM rescata la distribución preferentemente periférica de las adhesiones focales y los niveles normales de fosforilación de FAK y paxilina. Finalmente, nuestros datos sugieren que RhoA podría estar asimismo relacionado con el desensamblaje de las adhesiones, ya que la transfección de Rho activo en las células silenciadas para RIAM recupera parcialmente el fenotipo de las células control. Globalmente, los datos indican que RIAM es necesario para la dinámica normal de las adhesiones focales, lo que sugiere que el defecto en la invasión de las células de melanoma deplecionadas para esta proteína podría basarse en alteraciones de este proceso.
Description224 p.-71 fig.-3 tab.-anexo.
URIhttp://hdl.handle.net/10261/148937
Appears in Collections:(CIB) Tesis
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