Regulación de la homeostasis del glucógeno: el papel de R6 y la enfermedad de Lafora

Abstract

El glucógeno es la principal reserva de energía en nuestras células y es una molécula esencial para nuestro cerebro. Sin embargo, muchas cuestiones sobre el complejo metabolismo de este carbohidrato siguen por elucidar. Un paso clave en la regulación de la homeostasis del glucógeno es el llevado a cabo por la proteína fosfatasa de tipo 1, PP1. PP1 es capaz de estimular la síntesis de glucógeno mediante la desfosforilación de dos enzimas clave: la glucógeno sintasa (GS) y la glucógeno fosforilasa (GP). La fosfatasa necesita unirse a subunidades reguladoras para el reconocimiento de los diferentes sustratos. En el metabolismo del glucógeno, se han descrito hasta la fecha 7 de estas subunidades reguladoras, siendo R6 una de las más ubicuas y presente mayoritariamente en músculo esquelético, corazón y cerebro. En este trabajo hemos analizado la capacidad glucogénica de R6 en células de neuroblastoma de ratón. Se han estudiado además los diferentes dominios de unión presentes en R6 y su implicación en la regulación de la síntesis de glucógeno. Se ha caracterizado el motivo de unión de R6 a PP1 (R102VRF ) así como la zona de interacción con los diferentes sustratos: GS y GP (W267DNND). La unión a estos dos dominios de interacción ocurre de manera independiente, sin embargo, la pérdida de unión en cualquiera de ellos impide la estimulación de la síntesis de glucógeno producida por R6. Asimismo, hemos definido un nuevo dominio presente en R6 implicado en la unión a las proteínas 14-3-3 (RARS74LP). Esta unión media la regulación de la capacidad glucogénica de R6 ya que, cuando se impide la unión a la subunidad reguladora, la acumulación de glucógeno producida por R6 se ve exacerbada. Además, la unión de las proteínas 14-3-3 a R6 previene su degradación lisosomal, regulando por tanto la estabilidad de la proteína. Este mecanismo de regulación novedoso añadiría un grado más de complejidad a la homeostasis del metabolismo de glucógeno, mostrando una nueva manera de señalización. En este trabajo de tesis doctoral también hemos abordado la regulación del metabolismo del glucógeno en la enfermedad de Lafora (LD. OMIM 254780) y su relación con la subunidad reguladora R6. La enfermedad de Lafora es una enfermedad neurodegenerativa autosómica recesiva que conlleva epilepsia mioclónica progresiva y presenta un desenlace fatal. Debuta durante la adolescencia con ataques generalizados tónico clónicos, mioclonias, ausencias, desvanecimientos y alucinaciones visuales. La enfermedad progresa con demencia progresiva con apraxia, afasia y pérdidas visuales que llevan a los pacientes a un estado vegetativo y a la muerte, que tiene lugar generalmente a los 10 años desde la aparición de los primeros síntomas. Una marca de la enfermedad es la acumulación intracelular de “glucógeno insoluble”, los denominados cuerpos de Lafora. Dichas inclusiones aparecen en el citoplasma de múltiples tejidos entre los que se incluyen cerebro, riñón, piel, hígado y músculo esquelético y cardiaco.

La composición de los cuerpos de Lafora se asemeja a la de un glucógeno pobremente ramificado, con características similares a un poliglucosano de plantas, la amilopectina, que le confieren la falta de solubilidad y por tanto, la aparición de inclusiones. Las mutaciones que causan la enfermedad de Lafora han sido identificadas en dos genes EPM2A y EPM2B, aunque hay evidencias de un tercer locus. EPM2A codifica para una fosfatasa dual, la laforina, con un dominio de unión a carbohidratos en la región N-terminal de la proteína. EPM2B codifica la proteína denominada malina, una E3 ubiquitin ligasa con un dominio RING en el extremo N-terminal y seis dominios NHL en la región C-terminal que están implicados en interacciones proteína-proteína. La presentación clínica en con mutaciones en uno u otro gen es muy similar, lo que sugiere que ambas proteínas operan en rutas fisiológicas similares. Aunque se conocen las dos principales proteínas que pueden causar la enfermedad, todavía esta muy poco claro cual es el papel fisiológico de ambas proteínas y como su ausencia o defecto pueden provocar efectos tan devastadores en el organismo que indefectiblemente llevan a la muerte de los pacientes afectados de esta enfermedad. El hecho de que uno de los determinantes histológicos que caracterizan la enfermedad de Lafora sea la acumulación de inclusiones intracelulares similares a glucógeno, sugiere que malina y laforina podrían estar involucradas en la regulación de la biosíntesis de glucógeno. Se ha descrito que laforina interacciona físicamente con malina reclutando substratos específicos para ser ubiquitinados por malina. Algunos de estos sustratos están implicados en la regulación de la biosíntesis de glucógeno, tal como la forma muscular de la glucógeno sintasa, la enzima desramificante de glucógeno y alguna subunidad reguladoras glucogénica de la fosfatasa de proteínas de tipo 1 (PP1) como R5/PTG. En esta tesis doctoral se ha descrito la relación funcional entre laforina y malina, las dos proteínas relacionadas con la enfermedad de Lafora, y R6. El complejo formado por laforina y malina es capaz de ubiquitinar a R6 y conducirla a degradación lisosomal. De esta manera, este complejo regula los niveles de proteína presente y la acumulación de glucógeno inducida por R6, controlando así la síntesis de glucógeno promovida por la subunidad reguladora. Dado que la enfermedad de Lafora es una enfermedad neurodegenerativa, hemos abordado por último el estudio del metabolismo de glucógeno en el cerebro.

El metabolismo del glucógeno tiene un papel fundamental para el correcto funcionamiento de este órgano, en especial en la cooperación entre neuronas y astrocitos. En periodos de intensa actividad neuronal o durante episodios de hipoglucemia, el astrocito es capaz de generar lactato a partir de glucógeno, el cual puede ser usado por las neuronas adyacentes para continuar su normal funcionamiento. Por tanto, el glucógeno proveniente de los astrocitos provee de una neuroprotección contra la hipoglucemia o isquemia cerebral. En este trabajo hemos determinado que existe una alteración en el metabolismo del glucógeno en astrocitos provenientes de ratones modelo de la enfermedad (KO-malina y KO-laforina) de siete días de edad. En condiciones de crecimiento de alta glucosa, estos astrocitos primarios acumularon más glucógeno que los astrocitos control. Al contrario de lo que sucede con los cuerpos de Lafora, cuando los cultivos de astrocito primario fueron sometidos a ayuno de glucosa, observamos que este glucógeno acumulado se pudo degradar, presentando características similares a las de un glucógeno fisiológico. Además, se ha determinado que esta degradación ocurre mediante la acción de la glucógeno fosforilasa, mostrando que la maquinaría de degradación del glucógeno no está alterada en astrocitos primarios modelos de la enfermedad. Todos estos estudios además de ir encaminados a elucidar los mecanismos de patogenia de la enfermedad de Lafora, pueden ayudar a desvelar un posible tratamiento de la misma por modulación de las subunidades reguladoras glucogénicas de PP1, así como contribuir a una mayor comprensiónp del metabolismo del glucógeno.